WB全攻略之蛋白样本制备（一）

免疫印迹(Immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blot，WB)，是一种综合性的免疫学检测技术。该技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WB实验一般分为SDS-PAGE样本制备、凝胶电泳、转膜印迹、免疫学检测等步骤。我们有全套WB试剂，能够帮助大家获得满意的条带。

今天我们详细了解一下样本制备。

样本制备又分为材料的获取、蛋白裂解、蛋白定量、蛋白定性等四个小步骤。

实验前准备：目的蛋白特性的研究

首先请思考这些你都知道吗？

• 所用的细胞／组织中表达靶标蛋白吗？
• 表达丰度如何？是否在WB的检测范围内？（目前认为WB的有小检测下线为0.1-1ng）？
• 靶蛋白的亚细胞定位是哪里？靶蛋白分子量是多少？
• 是否需要特殊刺激才会表达？
• 是否在疾病组织或细胞中才会有表达？
• 是否有多种异构体？是否有多种翻译后修饰形式？

不知道?请参考：《在吗？常用WesternBlot数据库网站了解一下》

微信：https://mp.weixin.qq.com/s/ykkt89UBH1X5cDJxWg6bKg

材料的获取及裂解：

材料又可以分为培养物（细胞、细菌）、植物组织、动物组织。

• 培养物如果是细菌，可以收集离心去上清，后可用等渗中性溶液洗涤数次，再使用细菌抽提试剂盒；
• 培养物如果是细胞，可以用细胞刮将细胞刮下离心收集，也可直接再培养皿中直接裂解。不建议使用胰酶消化；
• 植物组织可采用植物蛋白抽提试剂盒；
• 动物组织可采用RIPA裂解液，或其他合适的裂解液进行相关的实验；

蛋白样本制备原则：

• 标准化、重复性
• 尽量抽提完全
• 所有蛋白处于溶解状态
• 防止蛋白的降解、聚集、沉淀、变性
• 防止蛋白翻译后修饰的改变
• 必要时去除核酸和某些干扰蛋白

我们希望活动高得率的蛋白，什么是高得率呢？

高得率：足量、完整的蛋白样品，尽量减少杂质干扰，浓度适宜

这就要求我们选择合适抽提试剂。大家是不是常使用RIPA裂解液提取总蛋白呢？

RIPA 裂解液用于样品总蛋白提取已经有三十多年的时间，那它到底靠不靠谱？

有几篇文献曾经报道，RIPA 裂解液提取总蛋白，可能会有部分不可溶的蛋白丢失：

• 引起蛋白图谱的改变
• 改变不同种类蛋白的比例
• 改变某些蛋白的活性

这种情况细胞尤其在特殊蛋白研究时会影响重大，比如激酶活性、磷酸化蛋白质、细胞外基质研究、定性定量蛋白研究等等。所以不同活性蛋白或是亚细胞蛋白要选择合适裂解液，不是全部选择RIPA就可以的。

想了解裂解液的选择，请参考：《RIPA裂解液你用对了吗？》

https://mp.weixin.qq.com/s/LxyIZ5m2oGSdjSyjk80Maw

蛋白酶、磷酸酶抑制剂

内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解，磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。

常见问题：

Q：只买PMSF可以吗？

A：PMSF为苯甲基磺酰氟 (PMSF) ，是胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶和木瓜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的抑制剂，而Protease Inhibitor Cocktail是多种蛋白酶的抑制剂，效果更全面。

Q: 磷酸化蛋白和总蛋白在裂解时要注意什么？

A: 磷酸化蛋白（如p-ERK）：蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂

总蛋白（如ERK）：蛋白酶抑制剂

磷酸化蛋白+总蛋白：蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂

蛋白定量：

凝胶电泳时，要求蛋白的上样量尽量一致，后续的结果才更加可信。在电泳之前需要对样本中的蛋白浓度进行定量，常用的方法包括Bradford考马斯亮蓝法（染料结合）和BCA法（铜离子结合）。BCA法比Bradford法灵敏度更高，并且抗干扰能力更强。BCA兼容去垢剂，但是不兼容还原剂；Bradford法能够兼容还原剂，所以，可以根据裂解液的成分选择合适的定量试剂盒。

蛋白变性：

还原剂 许多蛋白质在天然条件下存在二硫键会形成多个分子的聚合体，另有少数蛋白质在制样的过程中也会自发形成二硫键，在裂解液中引入还原剂可以有效地还原二硫键，使得蛋白质都以单体形式存在。常见的还原剂有 DTT（二硫苏糖醇）和 BME（ beta- 巯基乙醇），在蛋白制备中这两种还原剂都具有较好的效果。

变性 为了能使抗体接近抗原表位，必须将蛋白质的三维构型打开，因此需要将蛋白质变性。一般使用含阴离子变性去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液， 95-100℃煮沸 5 min；

注意膜蛋白的变性：70℃ 加热10分钟，对于多重跨膜蛋白尤其建议,因为煮沸可能会使膜蛋白发生聚合。

看完这一篇，你将获得一份高质量的样本。下次我们再看看电泳这一步骤的注意事项，欢迎围观。