做WB的同学，看这里就够了！
免疫印迹(Immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blot，WB)，是一种综合性的免疫学检测技术。该技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WB实验一般分为SDS-PAGE样本制备、凝胶电泳、转膜印迹、免疫学检测等步骤。我们有全套WB试剂，能够帮助大家获得满意的条带。
样本制备又分为材料的获取、蛋白裂解、蛋白定量、蛋白定性等四个小步骤。
1. 材料的获取及裂解：
材料又可以分为培养物（细胞、细菌）、植物组织、动物组织。
培养物如果是细菌，可以收集离心去上清，后可用等渗中性溶液洗涤数次，再使用细菌抽提试剂盒；
培养物如果是细胞，可以用细胞刮将细胞刮下离心收集，也可直接再培养皿中直接裂解。不建议使用胰酶消化；
植物组织可采用植物蛋白抽提试剂盒；
动物组织可采用RIPA裂解液，或其他合适的裂解液进行相关的实验；
2. 蛋白酶、磷酸酶抑制剂
内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解，磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。
3. 蛋白定量：
凝胶电泳时，要求蛋白的上样量尽量一致，后续的结果才更加可信。在电泳之前需要对样本中的蛋白浓度进行定量，常用的方法包括Bradford考马斯亮蓝法（染料结合）和BCA法（铜离子结合）。BCA法比Bradford法灵敏度更高，并且抗干扰能力更强。BCA兼容去垢剂，但是不兼容还原剂；Bradford法能够兼容还原剂，所以，可以根据裂解液的成分选择合适的定量试剂盒。
4. 蛋白变性：
还原剂 许多蛋白质在天然条件下存在二硫键会形成多个分子的聚合体，另有少数蛋白质在制样的过程中也会自发形成二硫键，在裂解液中引入还原剂可以有效地还原二硫键，使得蛋白质都以单体形式存在。常见的还原剂有 DTT（二硫苏糖醇）和 BME（ beta- 巯基乙醇），在蛋白制备中这两种还原剂都具有较好的效果。
变性 为了能使抗体接近抗原表位，必须将蛋白质的三维构型打开，因此需要将蛋白质变性。一般使用含阴离子变性去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液， 95-100℃煮沸 5 min；
1. 凝胶制备：
凝胶制备时注意：
a. 洗净玻璃板，请勿留有残胶；
b. 选择合适的分离胶浓度以确保目的蛋白的迁移位置再胶的中央；
2. 预制凝胶
目前我们推出3个体系蛋白预制胶：HEPES、Tris-Glycine和Tricine，常用于Western Blot检测。
产品优势：
与国内外主流mini型电泳槽兼容
预制胶中均不含SDS
多类型选择均一浓度胶、梯度胶、10孔/15孔
蛋白非特异性吸附少
稳定性和重复性俱佳
保质期长（分别为18个月/12个月/1个月）
3. 上样与电泳：
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准（蛋白预染Marker）。
电泳完成后，要将凝胶中的蛋白转移到转印膜上，常见的转印膜有NC膜和PVDF膜。
转膜完成后要用高蛋白的封闭剂对膜进行封闭，防止抗体和膜发生非特异性结合，常用的封闭剂有BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等，缓冲液通常有TBST或者PBST。
1. 内参抗体
内参一般指管家基因编码表达的蛋白，在各个组织和细胞中表达相对恒定，在检测某些功能蛋白的表达水平变化时用它作参照，可以校正蛋白定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
2. 酶标二抗
3. 发光底物
4. 信号增强剂
5. 抗体剥离试剂
6. Western加速器
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