ELISA实验宝典（酶联免疫吸附）

酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最广泛的免疫学检测技术，是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法ELISA。在测定蛋白质等大分子时常用双抗夹心ELISA方法。

▲ ELISA 原理

双抗体夹心法是检测大分子抗原最常用的方法。双抗夹心法ELISA是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体—抗原—固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。

▲ 双抗夹心法原理

A. 血清

全血标本自然凝集30min后1000×g离心15min，取澄清，即可检测。澄清可存放于-20℃，避免反复冻融。

B. 血浆

可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于2-8℃1000×g 离心15min，或将标本放于-20℃，避免反复冻融。（注意：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测）

C. 细胞上清

收集细胞培养液，离心取上清，-20℃存放，避免反复冻融。

D.细胞裂解样本

1. 收集细胞后，用预冷的10mM PBS洗3次，5000×g离心5min。

2. 细胞计数，离心弃上清；

3. 加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；

4. 按每1×10⁷个细胞，加入1ml细胞裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，其间上下颠倒使裂解更充分，超声波破碎处理；

5. 4℃，10000×g离心10min；

6. 检测细胞裂解样本总蛋白浓度；

7. 整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。

E. 组织裂解样本

1. 加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；

2. 预先将待检组织用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg组织加1mL裂解液，用研磨器进行研磨，得到的匀浆液可利用超声破碎处理；

3. 4℃，10000×g离心10min，取上清，-80℃存放；

4. 检测组织裂解样本总蛋白浓度；

5. 整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。

1.标准品和样本制备

2.酶标板拆分

3.标准品和样本点样

4.生物素抗体制备

5.洗液配制

6.浓缩HRP酶结合物工作液配制

7.显色

8.终止反应

9.上机与数据分析