细胞凋亡和周期的流式检测

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是在一定的生理、病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，在一系列酶的参与下，使生物体内一些无用的、老化的细胞高度有序、自动死亡的过程。凋亡是生物体内一种普遍存在的现象，贯穿于整个生命过程。

细胞凋亡有别于坏死，它具有自身的形态学特点和生化特征，形态上保持完整细胞膜结构的细胞皱缩，细胞核固缩，特异性胞浆大泡，染色质浓集，核破裂后被细胞膜包裹形成凋亡小体等。因凋亡细胞在组织中散在分布，细胞膜完整，不会引起局部炎症反应和损伤。

细胞坏死成团分布，细胞膜受损，DNA降解，细胞内容物外溢，会引起局部炎症和组织损伤。

检测原理

正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成，这些脂质之一磷脂酰丝氨酸（PS）通常仅分布于膜的内侧。在细胞凋亡过程中，脂质不对称性消失并且PS暴露在质膜的外部。

AnnexinV是一种36kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够与PS结合。因此，荧光标记的AnnexinV可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。AnnexinV还可以染坏死细胞，因为这些细胞的膜破裂，使AnnexinV可以进入整个质膜，但是AnnexinV就无法区分坏细胞死（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细胞。因此，通过与碘化丙啶（PI）共染色，可以将凋亡细胞与坏死细胞（中晚期凋亡细胞）区分开，因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI能进入坏死细胞（中晚期凋亡细胞）但是被早期凋亡细胞排除在外。

检测特点

简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，是最常用的凋亡检测方法。

检测方法 —— AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒

结果示例

1.由于AnnexinV与PS的相互作用具有钙依赖性，在AnnexinV实验过程中，要避免使用含有EDTA或其他钙螯合剂的缓冲液。

2.Annexin V只有在细胞膜完整的情况下才能当作细胞凋亡标志物。当细胞膜的完整性受到破坏时，AnnexinV会与细胞内的PS结合。

3.细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，前散射光降低。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大，侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响较大。因此在淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

4.Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。

5.流式细胞分析要求细胞分散、单个，处理之前活性好，这样才能区分死亡、凋亡和活细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，经过冻存的标本可以采用原位染色或免疫组化等方法检测。

6.检测贴壁细胞的凋亡时，建议用正常细胞摸索消化酶的浓度和消化时间，比如采用低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，离心机4℃1000rpm5min离心，避免过度消化使PS外翻，造成假阳性。尽量避免使用含EDTA的消化酶，如果不可避免，则需充分洗涤以消除对钙离子的影响。

7.用流式检测凋亡时，PI染色受时间的影响很大，PI有细胞毒性，随着时间延长会导致PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差也会明显加大。一般来说，PI在上机前5分钟加入，然后在1小时内检测完毕。检测凋亡时，受细胞状态、PI染色时间、上机时间以及每次实验时的误差等的影响，可以做复孔检测并可以适当重复2~3次，使差异减小。

8.如果没有明显的凋亡或不确定是否有明显的凋亡，可考虑荧光补偿的问题。

产品优点

检测原理

在细胞凋亡的过程中往往伴随着线粒体跨膜电位的破坏，这被广泛认为是细胞凋亡过程中最早发生的事件之一。线粒体膜电位的崩溃可能与细胞色素C相关。流式检测JC-1是检测线粒体膜电位常见方法。

阳离子染料JC-1有单体和多聚体两种存在状态，低浓度时，以单体存在，可检测到绿色荧光，高浓度时，以多聚体存在，可检测到红光，因JC-1浓度的变化,在单体和多聚体之间形成一个可逆的转变过程。

凋亡诱导后线粒体膜电位发生变化，导致膜通透性改变，JC-1对此改变非常敏感。正常细胞膜电位正常时，JC-1通过线粒体膜极性进入线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而凋亡细胞线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放，浓度降低，转变为发射绿色荧光的单体形式。

检测方法

结果示例

检测原理

细胞凋亡时核酸内切酶被激活，将细胞核染色体DNA从核小体处切断，暴露出的3’末端可以在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下加上荧光标记的dUTP(fluorescein-dUTP)或者Brdu，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。BrdUTP掺入率高于dUTP，灵敏度高且经济。

检测方法 —— TUNEL法

多聚甲醛固定细胞

TUNEL/PI双染

区分凋亡和非凋亡细胞

同时分析细胞周期

结果示例

细胞凋亡与疾病

凋亡不足：肿瘤、自身免疫病、病毒感染

凋亡过度：心血管疾病、血液系统疾病、重症肝炎、退行性神经疾病、阿尔茨海默病、帕金森症。

概念及检测原理

细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程，它反映了细胞增殖的速度。一个完整的细胞周期包含间期和分裂期（M期）两个阶段，间期又分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2期），处于不同时期的细胞的DNA含量存在差异。

一般认为，G1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环，是二倍体细胞；S期细胞，DNA含量逐渐增加，从二倍体变成四倍体，随后进入G2期，最终进入M期。检测细胞周期常用的方法是检测DNA含量，可以选择能与DNA结合的荧光染料（如PI），再根据细胞各个时期DNA含量不同从而荧光强度不同的方法，分析各个阶段的细胞比例。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

单参数DNA分析无法给出任何动力学信息，也无法区分G1期细胞与极早期的S期细胞，以及G2期细胞与S期晚期细胞，此外，G2期细胞与分裂期细胞同样无法区分。要解决这一问题，需采用溴脱氧尿苷(BrdU) 技术，也可结合细胞周期阶段特异性标记物（例如有丝分裂期的特异性标记物磷酸化H3）进行DNA分析。

检测方法 —— 碘化丙啶（PI）DNA染色法

结果示例

在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

除了基础细胞学研究，FCM的DNA测定在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中有很重要的作用，尤其对于早期缺乏客观明确指标的肿瘤，流式细胞术分辨率高、精准，可以提供客观而准确的资料。

试剂盒组份

体积：100 Tests: 40ml