T细胞流式解决方案

对于流式细胞分析，通常使用细胞表面蛋白和细胞内蛋白(例如细胞因子和转录因子)的荧光标志物组合。

分离出CD4+群体，可以通过使用抗CD3和抗CD28抗体交联共刺激TCR和CD28受体，实现T细胞活化和刺激。除了传统的抗CD3和抗CD28功能性抗体，还可使用抗CD3和抗CD28抗体共价偶联磁珠。Th1的体外分化方案是使用IL-12和IFNγ处理NaiveCD4+T细胞。

Th2细胞流式分析标志物组合：

CD45+ CD3+ CD4+ IL-4+ CCR4+ CRTH2+(CD8- CD19- CCR6- CXCR5- CXCR3- CCR10-)

Th2细胞的分化：

Th2细胞是由IL-4和IL-2特异性活化。IL-4刺激促进STAT磷酸化以及GATA3上调，GATA3是Th2细胞发育的关键转录因子。GATA3与IL-2诱导的STAT5信号转导相互作用，上调IL-4表达。紧接着是IL-4驱动的正反馈机制，即持续的IL-4-STAT6-GATA3和IL-5-STAT5信号转导不断的让Th2扩增。GATA3的IL-4依赖性STAT6活化是Th2细胞分化的经典途径。此外，有许多非经典途径被认为对Th2分化很重要，包括多种转录因子(如c-Maf，NF-κB，IRF4，AP1)和细胞因子(如胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)，IL-5，IL-25和IL-33)。

1、Th17细胞流式分析标志物组合：

对Th17细胞的分型通常依赖于关键效应细胞因子IL-17A或转录主要调节因子RORγt的细胞内染色，以及CD4表面表标志物，即CD4+IL-17+IFNγ-。另外，CCR6是趋化因子受体，在响应CCL20时驱动细胞迁移，由Th17细胞表达，但是CD4+CCR6+种群存在异质性，Th22也能表达。在对IL-17胞内染色之前，需用PMA、离子霉素和高尔基体阻断剂处理细胞。

2、Th17细胞的分化：

Treg的分类和命名已经标准化，包括三个主要的Treg种群：

胸腺衍生的Treg(tTreg)，此前被称为天然Treg。

外周Treg(pTreg)是由抗原刺激诱导外周淋巴组织(如肠道相关淋巴组织)中的naïveT细胞而来。

体外诱导的Treg(iTreg)则来源于在IL-2和转化生长因子β存在下用抗CD3刺激naiveCD4+ T细胞。

没有独特的标志物能完全区分这三个亚群。

Treg细胞流式分析标志物以及诱导分化因子:

流式分选Treg时，根据CD45RA和FoxP3表达强度区分的三群Treg细胞(CD4+CD45RA+FoxP3lowT、CD4+CD45RA-FoxP3highT和CD4+CD45RA-FoxP3lowT细胞)可以分别以分选CD45RA+CD25+(Fr.I)、CD45RA-CD25++(Fr.II)和CD45RA-CD25+(Fr.III)T细胞代替。

滤泡辅助T细胞(Tfh)是参与体液应答的CD4阳性辅助性T细胞的一个亚群。Tfh细胞存在于次级淋巴组织中，包括扁桃体、脾脏和淋巴结。Tfh细胞的作用是触发生化中心(GC)B细胞分化成分泌抗体的浆细胞和记忆性B细胞。

Tfh细胞是CD4+细胞，其可表达高水平的趋化因子受体5蛋白和转录因子B细胞淋巴瘤6，即CD4+CXCR5+BCL6+，其他的标志物包括表面标志CXCR3、ICOS、PD1和细胞因子IL-21。

一般认为，Tfh的分化需要在IL-6和IL-21同时存在的情况下，用MHCII特异性多肽刺激naiveCD4+T细胞TCR。

人CD8+T细胞不同亚群的细胞标志物：

小鼠CD8+T细胞亚群的标志物：

效应性CD8+T细胞表型和功能：

CD8+T细胞的活化和分化

CD8+T细胞介导的细胞毒性主要通过穿孔素、颗粒酶B、Fas-FasL途径和TNFα、IFNγ实现，因此，通过流式检测这些分子可以评价CTL的功能。

在体外多克隆活化CD8+T细胞，可以使用naiveCD8+T细胞3~4天，能实现T细胞扩增和活化，在体外诱导CD3/CD28介导的T细胞活化。激活后的细胞可以进一步与细胞因子和感兴趣的化合物一起培养，以进行分化和细胞因子分析。此外，应在细胞培养基中加入IL-2，以维持CD8+T细胞。