重磅来袭,高分文献带你了解动脉瓣钙化机制!





2022年2月由江苏省人民医院团队发表在《Cardiovascular Research》上的一篇关于动脉瓣钙化的文章,题为SPARC-related modular calcium binding 1 regulates aortic valve calcification by disrupting BMPR-II/p-p38 signalling。
该研究的最新成果确定了正常和高钙条件下SMOC1在房室钙化中的双重作用。



原文链接:https://doi.org/10.1093/cvr/cvab107

文章中使用的凋亡检测试剂盒(AnnexinV Alexa Fluor647/PI / 凋亡检测试剂盒:FMSAV647-100)来自 福麦斯自产品 



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研究背景

钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)是发达国家最常见的心脏瓣膜病,尽管CAVD的发病率和死亡率较高,但其病因和发病机制仍不清楚。

主动脉瓣间质细胞(AVICs)是主动脉瓣中最常见的细胞类型,对瓣膜稳态和重塑至关重要。

骨形态发生蛋白(BMP)属于转化生长因子b(TGF-b)超家族,是在发育和成人阶段促进成骨分化和骨形成的有效成骨生长因子。

在BMP成员中,据报道BMP-2、-4和-7可促进成骨细胞向成骨细胞的转化分化。BMP2在钙化性狭窄主动脉瓣中高度表达,并在主动脉瓣钙化中起关键作用。

SMOC1是一种分泌的酸性蛋白,富含半胱氨酸(SPARC)相关的模块化钙结合蛋白1,其特征是在各种组织中表达的基膜蛋白。

尽管SMOC1的生物学功能仍基本未知,但作为人类SMOC1直系同源物的爪蟾SMOC1蛋白通过影响MAP激酶抑制Smad1的C端磷酸化而起到BMP拮抗剂的作用,此外,SMOC1参与人骨髓间充质干细胞的成骨分化。

但是目前尚不清楚SMOC1是否以及如何调节AVIC和主动脉瓣钙化。

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研究方法

研究了不同条件下SMOC1在AVICs和主动脉瓣钙化中的作用。


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研究内容和结果


1、确定SMOC1在人主动脉瓣中的表达和细胞定位

研究团队首先检测了人钙化和非钙化主动脉瓣中SMOC1的表达水平。免疫染色显示SMOC1主要位于非钙化主动脉瓣的内皮层和亚内皮层。钙化主动脉瓣中内皮下层SMOC1的强度低于非钙化主动脉瓣,位于间质细胞区域的SMOC1主要见于钙化主动脉瓣(图1A)。
Western印迹还显示,钙化主动脉瓣的总SMOC1水平低于非钙化主动脉瓣(图1B)。因为SMOC1是一种分泌蛋白,研究团队检测了 SMOC1在瓣膜内皮细胞、瓣膜间质细胞和成纤维细胞中的内在表达,发现SMOC1仅由主动脉瓣内皮细胞表达,而不是AVICs或成纤维细胞(图1C)。
为了确认分泌的SMOC1是否可以进入AVICs,研究团队用重组SMOC1处理培养的猪AVICs(PAVIC),细胞质蛋白测定显示SMOC1被PAVIC吸收(图1D)。研究者进一步用转染有FLAG标记SMOC1腺病毒载体的HUVEC的条件培养基处理pAVICs,免疫荧光染色显示在pAVICs中检测到分泌的FLAG标记的SMOC1(图1E)。

Figure 1. SMOC1 is expressed by aortic valve endothelial cells and secreted into aortic valve interstitial cells.


2.过表达SMOC1抑制华法林和成骨介质诱导的钙化,但促进高钙介质诱导的P-AVICs钙化为了确定SMOC1对AVIC和AV钙化的影响,团队首先研究了SMOC1对之前报道的华法林钙化模型的影响。

研究者发现,SMOC1的过表达抑制了pAVIC钙沉积(图2A和B)和碱性磷酸酶(ALP)活性(图2C),并降低了成骨标志物的蛋白水平,包括RUNX2和BMP2(图2D-F)。
为了进一步证实体外结果,研究团队制作了一种在内皮细胞中特异性表达SMOC1的转基因小鼠模型,并用华法林诱导房室钙化。茜素红和von Kossa染色显示,SMOC1转基因小鼠的钙沉积量低于野生型(WT)小鼠(图2G和H)。免疫荧光染色显示,与WT小鼠相比,SMOC1转基因小鼠主动脉瓣中成骨标记基因(包括RUNX2和OPN)的表达显著降低,这与钙沉积减少一致(图2G和H)。

Figure 2. Overexpression of SMOC1 inhibits warfarin-induced AV calcification in vitro and in vivo.

为了进一步证实SMOC1对PAVIC钙化的影响,研究团队验证了其他两种公认的钙化模型。在成骨介质(OM)处理的模型中,SMOC1的过表达仍然抑制PAV钙化。然而,在高钙/磷酸盐培养基处理的模型中,SMOC1的过表达增加了PAV钙化(图3A-F)。接下来,研究者进一步证实了在肾功能不全加维生素D诱导的房室钙化模型中,SMOC1对高钙/磷酸盐介质诱导的房房钙化的相反作用。此外,免疫荧光染色显示SMOC1转基因小鼠主动脉瓣中RUNX2和OPN的水平显著升高(图3G和H)。这些结果表明,SMOC1在细胞外正常钙条件下抑制主动脉瓣钙化,但在细胞外高钙情况下增加主动脉瓣钙化。

Figure 3. Overexpression of SMOC1 promotes high extracellular-calcium-induced AV calcification in vitro and in vivo.


3.SMOC1对BMP2信号的抑制依赖于正常的细胞外钙条件

已报道非洲爪蟾SMOC1对BMP2信号负调节,为了证实SMOC1对PAVIC中BMP2信号的影响,研究者用重组人BMP2(rhBMP2)处理PAVIC。Western结果显示SMOC1抑制BMP2信号的下游靶点,包括p-Smad1/5和RUNX2。与rhBMP2的结果类似,SMOC1的过表达降低了华法林或OMT治疗的PAVIC中p-Smad1/5的水平(图4A)。相反,在高钙/磷酸盐培养基处理的pAVICs中,SMOC1增加了p-Smad1/5(图4B)。

为了进一步证实体外结果,研究团队测量了华法林和维生素D诱导的主动脉瓣钙化模型中p-Smad1/5的水平。与体外结果一致,与野生型小鼠相比,用华法林处理的SMOC1转基因小鼠的p-Smad1/5水平降低,但用维生素D处理的SMOC1转基因小鼠中p-Smod1/5水平升高(图4C-E)。

Figure4. SMOC1 dually regulates the phosphorylation of smad1/5 under different extracellular calcium conditions.

4.p38是SMOC1对房室钙化双重影响的关键因素

BMP2信号可通过激活p38 MAPK途径转导。为了确定为什么SMOC1在高钙/磷酸盐条件下对钙化产生相反的影响,研究团队验证了SMOC1对高钙/磷酸盐条件下pAVIC凋亡的影响以及用不同培养基处理的pAVIC中磷酸化p38(p-p38)的水平。SMOC1的过表达增加了高钙/磷酸盐模型中的细胞凋亡和p-p38水平(图5A),但随着华法林、OM和rhBMP2的加入,非高钙培养基中的p-p38水平降低(图5B-D)。数据表明,p-p38可能是SMOC1增强PAV钙化的重要介导因子。

作者研究了在高钙/磷条件下,抑制p38激活是否可以挽救SMOC1的作用。特异性抑制剂SB203580对p-p38的抑制(图5E)显著减弱了用高钙/磷酸盐培养基处理的SMOC1过表达PAVIC中钙沉积和成骨标记基因表达的增强(图5F-H)。这些结果表明,SMOC1通过增加p-p38介导的p-Smad1/5信号,促进高钙/磷诱导的pAVIC钙化。

Figure 5. P38 is a key mediator for the dual effects of SMOC1 on AV calcification.


5.SMOC1通过与BMPR-II的372–383氨基酸直接结合来抑制BMP2信号

为了进一步探索SMOC1如何调节p38介导的BMP2信号转导的机制,作者首先研究了 SMOC1和BMP受体之间是否发生了相互作用。通过BMP受体II(BMPR-II)或FLAG抗体进行的Co-IP和Duolink® 实验表明,在不存在细胞外高钙的情况下,在用rhBMP2处理的PAVIC中,SMOC1直接结合BMPR-II(图6A -B)。

考虑到高钙含量在SMOC1的双重效应中起重要作用,研究者提出细胞外钙结合(EC)结构域可能是SMOC1与BMPR-II相互作用的关键区域。研究团队生成了两个含有不同位点的SMOC1突变EC结构域的质粒载体,包括氨基酸372–383和409–420的突变。在共转染的293 T细胞中,与突变SMOC1和BMPR-II的共免疫沉淀显示,SMOC1与BMPR-II之间的相互作用取决于氨基酸372-383的基序(图6C)。为了确认氨基酸372-383是否有助于SMOC1介导的BMP2信号的抑制,又生成了具有氨基酸372–383突变的突变SMOC1腺病毒载体。共免疫沉淀显示,用突变SMOC1转染的pAVICs失去了与BMPR-II结合的能力(图6D)。此外,突变SMOC1的过度表达丧失了抑制p-p38和BMP2信号下游靶点的能力(图6E-H)。这些结果表明,含有SMOC1氨基酸372-383的基序对于SMOC1的生物学效应至关重要。

Figure 6. Amino acids 372–383 are the binding region of SMOC1 for BMPR-II and are essential for the regulation of BMP2 signal transduction.


6.SMOC1在高细胞外钙条件下增加BMPR-II表达并促进内吞作用

为了探索SMOC1在高钙条件下增强p-p38的原因,研究者使用交联膜蛋白验证了BMP2与BMPR-II的结合率,发现SMOC1没有增加BMP2与BMPR-II结合的能力(图7A-B),表明SMOC1不会影响BMP2在高钙情况下诱导的直接p-Smad1/5。接下来,研究者检测了高钙和正常钙条件下BMPR-II的蛋白质水平。结果发现,BMPR-II的增加仅在高细胞外钙条件下发现,SMOC1的过表达进一步增加了BMPR-Ⅱ的水平(图7C-D)。
由于p-p38介导的Smad1/5的激活依赖于小窝蛋白1介导的BMPR复合物的内吞作用,研究者用小窝蛋白1和SMOC1共转染pAVIC,然后用高钙/磷酸盐培养基处理 pAVIC。结果发现,高钙不会影响SMOC1和caveolin-1之间的相互作用,并增强pAVICs的内吞作用(图7E-G)。这些结果表明,高钙条件导致SMOC1与BMPR-II结合的亲和力丧失,但与caveolin-1结合的亲合力丧失,这增加了BMP诱导的信号复合物、内吞相关BMP信号和p-p38激活的形成。

Figure 7. SMOC1 promotes high extracellular calcium-induced AVIC calcification by increasing BMPR-II expression and endocytosis.

总结

  1. SMOC1主要由主动脉瓣内皮细胞表达,在人钙化主动脉瓣组织中,SMOC1的蛋白水平降低。
  2. SMOC1抑制华法林或成骨介质诱导的中骨钙化,但促进高钙介质诱导的体内外中骨钙化。
  3. SMOC1通过其EC结构域的氨基酸372–383与BMPR-II结合,抑制p-p38依赖性BMP2信号转导。
  4. SMOC1失去其与BMPR-II结合的能力,但在高细胞外钙条件下保持其与caveolin-1的结合,导致BMPR-Ⅱ表达和内吞作用增加。
总之,研究团队的工作确定了正常和高钙条件下SMOC1在房室钙化中的双重作用。结果表明了不同细胞外钙环境下BMP受体介导的信号转导的复杂性,并建议在不同钙浓度下应更多关注BMP受体的信号转导。研究表明,当临床治疗策略设计为靶向BMP受体时,应考虑血钙止血障碍。


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创建时间:2022-10-28 16:14