细胞凋亡——你想知道的都在这里!

 
01
细胞凋亡是什么

细胞凋亡cellapoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

 

 
02
细胞凋亡检测方法

下面我们简单介绍一下细胞凋亡的这7种主要方法:

1.电子显微镜观察

 

2.细胞核染色法检测

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3.线粒体膜电位检测

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4.细胞膜表面磷酯酰丝氨酸检测(流式检测)

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5.凋亡标志分子检测

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6.DNA片段化检测

 

7.DNA片段原位检测(Tunel

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03
常见问题解析
Q
凋亡阳性率过高?
 

A: 

1.细胞状态需要对比对照组;

2.考虑染色的条件优化;

3.消化时间的优化。

 Q
消化收集细胞后,凋亡阳性率低?
 

A:

1.是否使用了EDTA的胰酶消化,因为annexinVCa依赖的蛋白,所以不能加入EDTA,防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV,进而影响结果。所以你可以用不含EDTA的胰酶,放入温箱内进行消化,时间可以长一点,随时观察细胞情况,避免消化过度;

2.是否收集了上清中的细胞。

 

 Q
流式结果与Tunel结果差别大?
 

A: 

双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA片段化。而且TUNEL在检测过程中,把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞,而且如果TUNEL是肉眼计数的话,也会有判断上的误差,所以,往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。

 Q
左上象限细胞比例高?
 

A: 

跟细胞状态有一定的关系,坏死的细胞和凋亡的细胞是不一样的,如果细胞坏死破裂很多的话这时左上象限PI就很高了,再则,PI染的时间5-10分钟就可以了。我做的时候是采用PIAnnexinV分开染,PI先染或离心去掉染液,然后再加结合液和AnnexinV 10分钟后上机检测。PBS洗的目的有利于AnnexinV的结合反应,为了缩短实验时间和较少细胞损失,我一般也就洗一次。最后,我个人的观点是做实验时,细胞状态一定要好的情况下去做,不要勉强,这一既浪费试剂和时间,也往往得不到好的可靠的结果。你做的是贴壁细胞,中间有好多死的细胞,你可以先接种细胞,待细胞贴壁好了,然后再换一次液,这样就把那些死细胞去掉,接下来再加药物。

 Q
实验组,对照组差异不明显?
 

A: 

1.处理条件是否合适;

2.染色条件是否合适。

Q
流式或其他表型凋亡结果明显,但是检测蛋白caspase等明星蛋白分子结果不明显?
 

A:

1.这种时候,我们在排除了抗体,细胞蛋白样本没有问题的情况下,可以将思维打开,现阶段热门的研究例如焦亡(细胞膜在炎症小体剪切GSDMD后形成GSDMD-N,在其作用下形成膜孔),铁死亡(脂质过氧化物的过度聚集会导致膜破裂)都会呈现流式凋亡检测的阳性信号,这个时候涉及凋亡的指标分子检测很有可能就没有变化。

2.裂解液是否合适(参考文献:KevinA. Janes,2016.An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. SciSignal. ; 8371):rs2.doi:10.1126/scisignal.2005966.

 
 
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创建时间:2022-10-28 16:14