干货！史上最全组化解决方案！
免疫组化实验过程包括切片制作（固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片），脱蜡，水化，阻断，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，复染，封片，分析。
固定不及时或固定不完全，细胞核模糊，对比不鲜明。
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组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；
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固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；
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固定时间在4h-48h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；
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固定液的量要超过组织体积5倍以上。
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。
从1月1日开始，执行新的分时电价机制。根据《通知》，峰平谷时段、尖峰时段划分的更加清晰，对应的电价调整幅度更大。
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梯度酒精脱水尽量彻底充分；
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二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；
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浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。
左：乳腺癌组织石蜡切片，Mammaglobin染色阳性，脱片，烤片时间不足。
切片太厚，有刀痕，有褶皱，脱片。
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切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。
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切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。
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捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。
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粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。
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烘干温度为50℃，时间为12～24h。
脱蜡不全,组织出现异染现象,异染现象一般是苏木素着色不佳,HE染色没有选择性,染色不均匀。有的是伊红染不上。
根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
相同组织，不同PH抗原修复液修复结果不一样。没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。
封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性。
封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。
根据实验实际情况选择合适的封闭试剂和封闭时间。
染色液的堆积（黑色箭头区域）。
充分洗涤。
干片导致的假阴性（黑色箭头区域）。
加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。
边缘效应造成的非特异性染色（黑色箭头区域）。
组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。
左：癌细胞胞浆强阳性，抗体细胞特异性及细胞亚定位染色正确。
右：癌细胞胞膜弱阳性，抗体细胞特异性正确，细胞亚定位错误，该抗体特异性不准确。
抗体特异性差，定位不准确。
抗体的特异性是选择抗体最重要的原则，不同抗体特异性不同，组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性需都准确。
抗体的染色强度
左：癌细胞染色胞膜强阳性。
右：癌细胞染色胞膜弱阳性，抗体染色强度不够。
检测结果会出现弱阳性。
适当调整抗体稀释比，或者选择染色强度高，高亲和力的抗体。
抗体稀释比的影响
左：抗体1:8000稀释，略有背景。
右：调整抗体稀释比例1：30000，背景情况有所改善，抗原染色强度也有所降低。
染色结果出现非特异性染色或者是低背景。
当结果出现非特异性染色或者有背景时，可以适当调整一抗的稀释比例进行改善。
一抗孵育条件
左：一抗4°C过夜，癌细胞胞浆强阳性，背景干净。
右：一抗37°C-60min，癌细胞胞浆中等强度阳性，背景干净。
孵育条件对染色结果有影响。
选择合适的一抗孵育条件。
HER-2在4个不同乳腺癌的组织标本上的染色结果不同
染色结果与预期不符，检测阴性或者弱阳性。
设置阳性组织切片的对照，因为同一蛋白在不同组织中的表达会有很大的差异。
左：二抗为HRP直标二抗显色，染色结果弱阳性，低背景。
右：多聚物酶标记二抗显色，染色结果强阳性，背景干净，对比明显。
使用不同的二抗显色系统会出现不同的结果，可能会有弱阳性结果。
使用多聚物酶标记二抗比普通的HRP直标二抗灵敏度更高，背景更干净，对比更明显。
DAB絮状或团状沉积
产生深棕至黑色的DAB絮状或团状沉积于组织切片上。
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现配现用：因为DAB显色液配置好了之后极容易产生DAB的沉积，从而导致样本上会出现深棕色的絮状沉淀，干扰结果的判定。
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显色时间：所有说明书上的显色时间均为一个范围，有的反应迅速的30s-3min，有的反应缓慢的3-20min，应该灵活调整，最好是滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
信号偏弱
信号偏弱。
适当延长显色时间，滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
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不同的苏木素配方的染色时间各有不同，配置的新旧程度染色时间也不同。
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国际上常用的为Harris苏木素，因为配方中含汞，通常还需要进行分化，返蓝的步骤，但颜色亮丽。
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改良的Mayer苏木素配方不需要分化，时间可以根据配置的时间调整染色时间15s-2min。
