Milliplex BMS常见问题
Milliplex BMS常见问题
目前我们 Milliplex试剂盒应用的种属包括：人，小鼠，大鼠，非人灵长类，犬，猪等。绝大部分一个货号的 Milliplex试剂盒只能应用各自一个种属（见试剂盒名称）
如何根据感兴趣的因子挑选 Milliplex 试剂盒？
建议在我们的 Immunoassays & Multiplex Kits Analyte Quarterly季刊（季度更新）中使用搜索感兴趣的因子，然后选择一个包含最多待测因子数量的试剂盒。查看相关说明书，明确自己的样品类型是否是适用该试剂盒。另外，需要注意通过预实验或者可靠的参考文献判断样本的浓度是否在试剂盒的可检测范围内。
试剂盒的检测灵敏度是多少？
如果是定量试剂盒，请参考各自试剂盒说明书最后部分的Assay Sensitivities表格。我们一般会用MinDC±2SD来表示最低检测浓度。如果是定性试剂盒（例如信号通路检测相关产品），说明书中一般有数据显示多少微克细胞裂解液对应的MFI的图片。
一个试剂盒可以检测多少个样本？
目前我们的一个 Milliplex试剂盒提供一块96孔板，其中去除定量所必需的背景孔、标准品和质控(QC)复孔之后，剩余孔数为 76-78个孔（因标准品梯度数量而不同）。客户需要根据自己每个样本的重复数量来计算剩余孔可检测样本的数量。例如，样本复孔检测则可检测 38-39个样本。
每个孔都需要做复孔吗？
试剂盒中的质控(QC)是什么？起什么作用？
Milliplex 试剂盒提供两管不同浓度的质控(QC1 & QC2)，该质控是每款试剂盒配套的两管已知浓度的混合标准蛋白。其最终结果是评判检测标曲定量和准确性的重要标准。
不同类型样本在制备存储收集的过程中有什么要求？
1）血清样本收集和保存：
a.全血凝固30分钟以上，1000xg 离心10分钟。取上清，≤-20℃保存（建议样本在-20℃保存不超过一个月，如超过一个月，尽可能把样本保存在-80℃中）。
b.避免反复 (>2)冻融。
2）血浆样本收集和保存:
a.推荐使用EDTA作为抗凝剂，尽量避免肝素作为抗凝剂(过量肝素可能造成检测结果偏高,若使用肝素抗凝，请确保肝素浓度低于10 IU /mL。
b.取全血，30分钟内离心，离心条件：1000xg，10分钟。取血浆，≤ -20℃保存，（建议样本在-20℃保存不超过一个月，如超过一个月，尽可能把样本保存在-80°C中）。
c.避免反复 (>2)冻融。
3）细胞培养上清样本收集和保存:
a.离心，去除细胞碎片等杂质，收集上清，≤-20℃保存（建议样本在-20℃保存不超过一个月，如超过一个月，尽可能把样本保存在-80℃中）。
b.避免反复 (>2)冻融。
4）尿液样本收集和保存
用于肾毒性相关试剂盒：HKI1MAG-99K,HKI2MAG-99K,HKI3MAG-99K,MKI1MAG-94K,MKI2MAG-94K,RKTX1MAG-37K,RKTX2MAG-37K,CKT1MAG-97K,CKT2MAG-97K
a.离心，去除碎片，取上清，≤-20℃保存（建议样本在-20℃保存不超过一个月，如超过一个月，尽可能把样本保存在-80℃中）。
b.避免反复 (>2)冻融。
5）细胞裂解液样本收集和保存：
用于信号通路检测相关试剂盒。下面protocol中用到的1×Milliplex MAP裂解液货号：43-040。
a.贴壁细胞裂解保存
①冰预冷的PBS或者TBS洗贴壁细胞；
②加入冰预冷的1×Milliplex MAP裂解液（用前加蛋白酶抑制剂），裂解液建议用量：150mm dish 加0.6ml, 100mm dish 加0.3ml, 24孔板每孔加入0.1ml
③细胞刮取下细胞，并转移到离心管中，4°C轻柔振荡10-15分钟
④滤膜过滤去除杂质碎片，滤膜选择建议：
≥2ml,采用EMD Millipore Catalog#SLPBDZ5NZ
0.5-2ml,采用EMD Millipore Catalog#UFC0DV25
≤0.5ml,采用EMD Millipore Catalog#UFC30DV00
⑤收集裂解液，-80℃保存。
b.悬浮细胞裂解保存
①500-1000×g，离心5分钟，收集细胞沉淀
②冰预冷的PBS或者TBS清洗细胞
③加入冰预冷的1×Milliplex MAP裂解液（用前加蛋白酶抑制剂），裂解液建议用量：1×107细胞中加入1ml裂解液
④4°C轻柔振荡10-15分钟
⑤滤膜过滤去除杂质碎片，滤膜选择建议同上
6）组织裂解液样本收集和保存：
由于组织类型的多样性，关于组织裂解液我们没有一个统一推荐的protocol，研究者需要根据自己的情况进行优化。通常来说，大多数ELISA实验用的protocol可适用，下面是一些需要遵循的原则：
a.将组织用包含蛋白酶抑制剂（如aprotinin 或者inhibitor cocktail）和低浓度（小于0.2%）非离子型去垢剂的PBS缓冲液进行匀浆（超声或机械匀浆）。
b.裂解液不要包含任何有机溶剂如DMSO。
c.组织裂解液离心，取上清，≤-20℃保存。（建议样本在-20℃保存不超过一个月，如超过一个月，尽可能把样本保存在-80℃中）。
7）注意事项:
a.样本采用聚丙烯试管（polypropylene tube）保存。请勿使用玻璃制品保存样本。
b.避免使用严重溶血和高血脂样本。
c.抗凝剂EDTA终浓度取决于不同的抗凝管，一般来说，EDTA终浓度在1.8mg每毫升血液的范围附近。尽量避免肝素作为抗凝剂，因为过量肝素可能造成检测结果偏高。若使用肝素抗凝，请确保肝素浓度低于10 IU /mL。
d.某些试剂盒内检测因子需特定蛋白酶抑制剂：
HMHEMAG-34K；MMHMAG-44K；RMHMAG-84K；CGTMAG-98K；FMHMAG-29K；MGTMAG-78K；
NHPMHMAG-45K，上述试剂盒中，如果选择下列检测因子，需加对应的特定蛋白酶抑制剂：因子：GLP-1 (active)；对应蛋白酶抑制剂：DPPIV inhibitor(Millipore Cat#DPP4/DPP4-010) 因子：Amylin(both total and active)；对应蛋白酶抑制剂：Protease Inhibitor cocktail (Sigma Cat#P2714, Millipore Cat# 20-201)
因子：Ghrelin (active)；对应蛋白酶抑制剂：Serine protease inhibitor (PefablocSC /AEBSF: Roche Cat # 1429868,Sigma cat# A8456)
如果同时检测不止一种以上蛋白，则需要叠加蛋白酶抑制剂。
e.其他特殊样本，如体液、分泌滑液、泪液等，请联系默克密理博技术支持：400-889-1988-2号分机
样本存储时间和温度有什么要求？
样本内待测因子的稳定性与冻融的次数相关，如果超过 2次冻融，那么样本会出现明显的降解。一般我们建议尽可能使用新鲜采集的样本，样本在-20℃保存不超过一个月，如果超过一个月，尽可能把样本保存在-80℃中。样本需干冰寄送。
用血清或血浆做样本，这两个样本得到的数据有差异吗？
对于某些试剂盒，我们的确看到血浆样本的结果与血清的不同。有些分析物可能在血浆中含量高，而某些分析物则在血清中含量较高。为此需要参考一定的文献来辅助判断。
血浆样本在解冻后发现有沉淀，是否会影响实验？
在血浆样本冻融后发现有沉淀是由纤维蛋白凝集(Fibrin clots)造成的，只要样本进行离心取上清，一般不会影响后续的实验（纤维蛋白凝集现象在血清样本中并不常见）。
样品溶血会对检测结果造成什么影响？
溶血会导致蛋白水解酶从红细胞中释放出来；此外，血红蛋白(>10mg/ml)被认为会干扰抗原抗体的结合。所以溶血样本将会干扰检测反应，并不同程度地影响结果准确性及稳定性。
血脂样本会对检测结果造成什么影响？
高血脂样本会对检测操作带来吸样和加样的干扰，从而不同程度地影响结果准确性及可重复性。此外，过多的脂肪物质带入反应可能会干扰磁珠抗原抗体的结合。
制备细胞和组织裂解样本时，有没有推荐的 protocol 可以提供？
关于组织裂解液我们没有一个统一推荐的 protocol，因为不同的组织类型都会有不同的特殊要求，单一的 protocol 没有也很难经过所有样本类型的逐个验证，客户需要根据自己的情况进行优化。通常来说，大多数ELISA 实验用到的 protocol 都可以适用，下面是一些需要遵循的原则：
1）将组织用包含蛋白酶抑制剂（如aprotinin 或者inhibitor cocktail）和低浓度（小于0.2%）非离子型去垢剂的 PBS缓冲液进行匀浆（超声或机械匀浆）
2）裂解液不要包含任何有机溶剂如DMSO。
3）将组织裂解液离心并将上清冻存在-20℃或以下。
4）以裂解液作为 matrix 加入空白背景孔，标准品以及QC 的孔中。
组织裂解样本使用的裂解液中包含了去垢剂 SDS，是否会对实验造成影响？
组织样本处理时如果裂解液中包含一些离子去污剂如SDS，NP40，可能会在实验中观察到较低的数值，因为这些去垢剂会影响抗体抗原的结合。我们建议用的去垢剂是浓度低于 0.2%的 Tween20 或者Triton X-100。如果不能更换裂解液成分，需要通过预实验检测验证，在上样前用试剂盒提供的 Assay buffer对样本进行1:1稀释。
每孔检测所需总蛋白量是多少？
5-25 ug/well
如何确定样本的稀释比例？
对于试剂盒验证过的样本（如血清/血浆等），试剂盒说明书都会有明确的稀释比例和建议。并提供相应稀释或者进一步稀释的稀释试剂。而对于没有验证过的客户特异性的样本类型，需要客户参照相关文献和试剂盒可检测范围在预实验的基础上针对性的调整稀释比例。
