干货开讲 | 你想了解的细胞周期都在这！

1

对照问题

不需要设置空白对照（不染色细胞），但需要根据实验自行设计阴性对照；

2

避光问题

染色过程中关闭灯光，核酸染料孵育时放置暗盒避光孵育；

3

固定液

常用固定液有甲醛、甲醇和乙醇。但甲醛可减少染料结合，因为它们可诱导染色质交联。甲醇高浓度会造成细胞成团，很难重悬成单细胞，影响固定效果。DNA在组蛋白里，乙醇是沉淀剂，是目前用于制备周期样品最好的固定剂。一定要用纯水配置70%乙醇，PBS有盐析出会对细胞造成物理性伤害；

4

固定时间

最少需要4小时，固定过夜；

5

操作轻柔

不可过度吹打，防止细胞碎片过多；

6

细胞接种密度适中

细胞密度过密导致细胞停止增殖分裂，细胞滞留在G0/G1期。可以先预实验，避免细胞密度过密；

7

样本上机

流式检测周期必须以低速检测细胞，因为低速可保证细胞之间的差异尽可能的小，获得更高的精确度；

8

流式上机获取足够的细胞

一般计数2~3万个细胞。细胞周期分析需要用某个数学模型拟合数据，这些模型对S期、G1、G2/M期进行了不同的假设性推算，因此，需要有足够多的数据供模型拟合。如果细胞比较少,建议减少离心次数。如果药物处理后细胞死亡过多，应该降低药物浓度；

9

注意排除粘连体细胞

粘连体细胞容易与G2/M期细胞混淆起来，增加假阳性结果。我们可以通过以下三个方式减少其干扰：制备好的单细胞悬液；注意固定操作并记得在上样前过滤标本；确保分析时使用H、W和A等参数来设门排除粘连体。