干货分享 | Co-IP实验流程及对照设置

本周干货分享

免疫共沉淀的

实验流程及对照设置


免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。



免疫共沉淀操作步骤是将抗体先结合到蛋白A/G微珠上,然后再与抗原混合。相对其他方法,最终的得率较低,但避免了抗体共洗脱的问题。如果希望获得高纯度的目的蛋白,而不考虑非特异性结合,可以将抗体和蛋白样品在加入蛋白A/G微珠之前进行混合,这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来,从而可能会对蛋白质印迹法(western blot)检测造成干扰。


免疫共沉淀实验大致流程

可分为以下4步

第1步:收集蛋白样品

蛋白样品通常通过裂解细胞得到。

Co-IP实验通常有两种,一种为内源性蛋白相互作用验证,另外一种为非内源性蛋白相互作用验证,内源性相互作用是指两蛋白相互作用在细胞内发生,即通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达,表达完成后收集细胞进行裂解得到蛋白样品。非内源性相互作用两蛋白相互作用在细胞外发生,即将含有靶蛋白的动植物组织、器官进行预处理及细胞裂解获得细胞裂解液,随后将诱饵蛋白(通常为重组表达纯化获得)加入细胞裂解液中,得到蛋白样品。

第2步:沉淀诱饵蛋白

利用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白:

在样品中加入磁珠偶联抗体,抗体会与诱饵蛋白结合,利用磁铁将磁珠拉下,同时诱饵蛋白会一起被沉淀出来。如果存在与诱饵蛋白的相互作用的靶蛋白,也会被沉淀下来。如果没有诱饵蛋白的特异性抗体,可以给诱饵蛋白加上标签(Myc、HA、Flag等),然后利用标签抗体沉淀蛋白。

第3步:SDS-PAGE及WB检测

得到沉淀后,需要验证沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE将蛋白复合物分离,随后利用WB检测是否存在靶蛋白(如果靶蛋白的分子量是已知的,可以直接用SDS-PAGE检测是否存在靶蛋白)。


第4步:实验对照设置

为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用,而不是由于某些方面造成的人工相互作用(也就是“假阳性”),在Co-IP的实验设计过程中,需要设置正确的对照。

假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”,则可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照如下表所示:

上述为了避免出现“假阳性”的对照称为阴性对照,除此之外Co-IP实验还会设置一个阳性对照组(Input组),Input组为直接利用抗体X(抗体Y)对细胞裂解液进行WB检测,验证细胞裂解液中存在蛋白X(抗体Y)。

在某些Co-IP实验中,实验人员会把IP后的上清分别进行蛋白X和蛋白Y的WB检测,该对照组称为output组。

利用内源性Co-IP实验为验证两个蛋白是否存在已知作用,如果最终的结果为阳性,则可以证明两个蛋白之间存在相互作用;但如果结果为阴性,无法证明两个蛋白之间不存在相互作用,也有可能是蛋白在细胞内表达量低等原因导致。因此在进行内源性Co-IP验证两个蛋白是否存在相互作用时,建议先做过表达Co-IP作为对照。



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创建时间:2022-12-23 10:23