实验 | WB中上样与电泳操作的注意事项

免疫印迹（Immunoblotting）又称为蛋白质印迹（Western Blot，WB），是一种综合性的免疫学检测技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。

这项技术利用待检测蛋白与抗体的特异性结合，测定生物样本中的蛋白水平，已经被广泛应用并得到公认。

WB技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WB实验一般分为SDS-PAGE样本制备、凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育及免疫检测等步骤。

WB实验看似比较简单，但是它步骤多，时间长，很容易出现一些意想不到的小插曲，导致实验结果不理想。本文着重讲述在WB实验中，上样与电泳时需要特别注意的地方。

凝胶制备

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

它有两种形式：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成，形成一个三维网状的结构，它具有分子筛效应。

自制凝胶时的注意事项

①洗净玻璃板，请勿留有残胶；

②选择合适的分离胶浓度以确保目的蛋白的迁移位置在胶的中央，高比例的凝胶具有较小的孔径，用于分离分子量较低的蛋白，低比例的凝胶具有较大的孔径，用于分离分子量较大的蛋白，具体参考下表：

分离胶浓度	最佳分离范围
6%胶	50-150KD
8%胶	30-90KD
10%胶	20-80KD
12%胶	12-60KD
15%胶	10-40KD

③PH值正确，正确的保存条件，APS需新鲜配制；

④分离胶勿倒过满，凝胶需缓慢凝固，胶太硬时电泳时易烧；

⑤聚丙烯酰胺凝胶在凝固前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上口罩和手套；

⑥板条与梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量。

现在很多厂家都会生产不同浓度的预制胶，方便客户使用，客户也节省了不少的时间。预制胶的优势明显，有高分辨率的数据，与主流的电泳槽兼容，上样量大，成本低等。（但是！在用预制胶的时候，切记要撕胶底或侧边的封条，并且拆胶的时候动作轻缓，防止把胶拆坏。在电泳槽中倒入电泳缓冲液，静置一会儿，拔梳齿时注意垂直，保持梳齿的平整。）

上样与电泳

蛋白预染Marker：采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，为了便于观察电泳效果与转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准。根据待测蛋白的分子量大小，挑选合适的Marker。

加入足量的样品：SDS-PAGE根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-30μg总蛋白或100ng纯蛋白；对于组织，我们通常建议上样量最多100μg总蛋白，具体取决于靶标表达水平；但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能还需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。

尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，方便后续观察蛋白的表达量。

空置的泳道用等体积的1x Loading Buffer补齐，防止最后的一两个样品条带上扬。