本周干货：模式识别受体之TLR蛋白

先天免疫系统是宿主抵御病原微生物的第一道防线，并依赖于种系编码受体，也称为模式识别受体（PRR）。

这些受体识别在微生物上表达的分子特征，称为病原相关分子模式（PAMPs），以及在受损宿主细胞上表达的分子基序，称为损伤相关分子模式（DAMPs）。

PRR与PAMP和DAMP的相互作用可导致促炎细胞因子和其他免疫调节分子的表达（图1）。PRR主要由抗原呈递细胞（APC）表达，包括树突状细胞和巨噬细胞，但它们也会在其他免疫细胞和非免疫细胞上表达。

在哺乳动物的几种不同类型PRR中，Toll样受体（TLR）有相当广泛的研究。其他模式识别受体包括RIG-I样受体（RLR）、Nod样受体（NLR）、AIM2样受体（ALR）和C型凝集素受体（CLR），以及cGas和其他细胞内DNA传感器（见图1）。

▲ 图 1

先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）识别出各种病原体。

这些免疫细胞表达模式识别受体（PRR），它们能够识别病原诱导的感染是通过某些蛋白质和其他分子基序（被称为病原相关分子模式（PAMP）和损害相关分子模式（DAMP）），而PAMP和DAMP分别是在病原体和受损宿主细胞上发现的。模式识别受体包括Toll样受体（TLR）、核苷酸结合的寡聚结构域样受体（Nod样受体，简称NLR）和C型凝集素受体（CLR）。

Toll样受体（TLR）信号通路

Toll样受体在先天免疫系统中发挥重要作用，主要是识别病原相关分子模式。Toll样受体由树突状细胞（DC）、巨噬细胞和非免疫细胞（如纤维原细胞）表达。Toll样受体可以根据其细胞位置进行分类。人的TLR家族由10个成员组成（TLR1-TLR10），而小鼠TLR家族有12个成员（TLR1-TLR9，TLR11-TLR13）。细胞表面TLR包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，并都有胞外的结构域。胞内TLR包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，它们位于内质网（ER）、内体和溶酶体中。细胞表面TLR识别细菌膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质，而细胞内TLR主要识别核酸。

TLR被认为是I型跨膜蛋白，由一个N端配体识别域、一个单次跨膜域和一个C端信号域组成。TLR的胞外域包含一段基序的串联拷贝，也称为富含亮氨酸重复结构（LRR），负责识别PAMP。TLR的细胞内信号域与IL-1受体同源，被称为Toll/interukin-1受体（TIR）域，这个信号域是发起下游信号通路所必需的。TLR激活相关的两个主要信号通路包括MyD88依赖通路和TRIF依赖通路（图2）。

▲ 图 2

病原通过TLR在APC上激发的信号通路

像TLR1这样的细胞表面TLR具有胞外域，而像TLR3这样的细胞内TLR是位于胞内的。同源或异源二聚体的形成能够诱导下游信号通路，主要是MyD88依赖通路或者TRIF依赖通路。TLR的下游通路引起促炎细胞因子的表达，包括IL-6、IL-8、IL-12和TNFα。

TLR免疫学研究

TLR是病原体检测中至关重要的传感器，因此识别和表征免疫细胞表面的TLR表达对于研究病毒清除的细胞机制具有重要意义。流式细胞术通常是分析免疫细胞TLR谱的首选方法。

一般来说，整个细胞群用活性染料染色，然后用TLR特异性荧光抗体进行免疫标记。为了对单细胞悬液中的所有活细胞进行染色，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗一次，并以1×10⁶个/mL重悬于染色缓冲液中。接下来，向细胞悬液中加入活性染料。然后将细胞在室温或冰上避光培养，用PBS冲洗一次，并重悬在染色液中。

TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，这些TLR在细胞表面有胞外域，因此可直接用荧光抗体识别目标TLR对细胞染色（图3）。细胞在冰上培养，用染色缓冲液冲洗，然后重悬在染色液中。可以用流式细胞仪进来分析细胞。如果上样前需要固定细胞，可以使用固定缓冲液。在短暂培养后，将细胞冲洗并重悬于染色缓冲液中，再上样到流式细胞仪。

TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，这些细胞内TLR的抗体染色，细胞必须固定并破膜，使抗体与抗原接触。细胞已经免疫标记了细胞表面抗原，再进行固定，并使用破膜缓冲液进行破膜。完成固定和破膜后，细胞与识别相关TLR的荧光抗体试剂一起培养。细胞与抗体在冰上培养，用破膜缓冲液冲洗一次，用染色缓冲液冲洗一次，然后重悬于染色缓冲液中。重新悬浮后，可以通过流式细胞仪来分析细胞。