免疫系统先锋部队的“自然杀伤细胞”
本期关键词：NK细胞解决方案
什么是NK细胞？
自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞 )，是除 T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，不表达T细胞和B细胞所特有的膜表面分子。无需抗原的预先刺激与活化即可直接杀伤被病毒感染的自身细胞或肿瘤细胞，与抗肿瘤、抗感染和免疫调节有关，是固有免疫最重要的组成成分之一。
1.NK细胞的分化和发育
NK细胞的分化发育在人和小鼠中存在较大差异：
在小鼠中CLP（common lymphoid progenitor，共同淋巴样祖细胞）先分化成CILCP（common ILC precursor，共同固有淋巴细胞前体），随后分化成NKP（NK progenitor，NK细胞祖细胞），NKP在转录因子的作用下分化成rNKP（refined-NKP），rNKP进一步分化成CD27+CD11b—NK、CD27+CD11b+NK和CD27-CD11b+NK这三种不同分化阶段的NK细胞亚群。
在人中CLP依次分化成CILCP和NKP，随后在转录因子T-bet和Eomes的作用下分化成CD56dim和CD56bright这两种不同分化阶段的NK细胞亚群。
2.NK细胞的定位
在人和小鼠体内，NK细胞除了存在于外周血中，在脾脏、淋巴结、骨髓、肺等组织中也有许多组织驻留NK细胞的存在，不同组织部位的NK细胞分化亚群的比例存在较大差异。
3.NK细胞的表面受体
NK细胞无T（TCR）、B（BCR）等专职受体，如何保证效应功能的调节？
NK细胞上存在大量受体、这些受体可以主要分为活化受体和抑制受体，这些受体与靶细胞上对应的配体结合，提供大量的活化或抑制信号，活化和抑制信号处于动态平衡，平衡的倾向决定NK细胞处于活化状态还是抑制状态。
4.NK细胞的应答方式
NK细胞通过平衡信号对病毒感染和转化细胞产生应答：
A、免疫耐受：NKG2A识别自身正常细胞上的非经典MHCⅠ类分子，NK细胞平衡倾向抑制，NK细胞细胞毒功能被抑制，呈现出免疫耐受状态。
B、诱导自身：NKG2DL通常在恶性转化的细胞上调，NKG2DL与NK细胞上的活化受体NKG2D结合，使NK细胞平衡信号倾向活化，NK细胞通过其细胞毒功能杀伤肿瘤细胞。
C、丢失自我：许多癌细胞下调MHC I分子的表达以逃避细胞毒性CD8 + T细胞的检测，然而，缺乏MHC I分子导致NK细胞抑制信号降低，使NK细胞平衡信号倾向活化，NK细胞通过其细胞毒功能杀伤肿瘤细胞。
NK细胞的功能及应用
1.NK细胞的功能
NK细胞的功能主要分为两大类：
（1）NK细胞的主要功能是其杀伤靶细胞的细胞毒功能，NK细胞能通过三条途径发挥其细胞毒功能：
A、NK细胞中含有大量的颗粒物，内含丰富的毒性颗粒-穿孔素（Perforin）和颗粒酶（Granzyme），这些毒性颗粒经免疫突触以脱颗粒的形式释放进入靶细胞，裂解靶细胞导致靶细胞凋亡。
B、NK细胞上表达肿瘤坏死家族的配体-FASL和TRAIL，这些配体与靶细胞上表达的对应的死亡受体结合，诱导靶细胞凋亡。
C、NK细胞上表达低亲和力Fc受体CD16，又称作FCγRIII，能识别和结合被抗体包被的细胞上抗体的Fc片段，通过ADCC效应（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ，ADCC ）发挥。
（2）NK细胞还能通过分泌大量的细胞因子（主要为CD56bright），如IL10、IFN-r、GM-CSF等作用于机体中其它免疫细胞，发挥免疫调节功能。
2.NK细胞应用
目前对NK细胞的应用主要集中在其抗肿瘤活性上，主要有如下方式：
A、直接输注可以促进NK细胞活性的IL-2和IL-15。
B、将来自健康供者（Healthy donor）的NK细胞在体外通过IL-2和IL-15进行刺激，然后回输到癌症患者体内。
C、通过基因工程手段改造NK细胞，装载上表达针对CD19、CD20等肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）的CAR分子，制备纯嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK），将CAR-NK细胞输注到患者体内，靶向杀伤肿瘤细胞，可分为来源于患者自身的自体CAR-NK和来源于健康供者的同种异体CAR-NK。
D、通过靶向TAA的治疗性抗体西妥昔单抗（cetuximab）和利妥昔单抗（rituximab）诱导NK细胞发挥ADCC效应，增强NK细胞对肿瘤细胞的免疫应答。
E、通过NK细胞衔接器-同时靶向瘤抗原（如CD19、CD20或EGFR)、NKp46和CD16的功能抗体将肿瘤细胞和NK细胞聚集在一起，触发NK细胞对肿瘤细胞的破坏和细胞因子的分泌。
NK细胞的来源和检测
1.NK细胞的来源
目前用于临床研究的NK细胞主要有以下四大来源：
A、原代PB-NK来源的NK细胞：从健康供者的PBMC中分离出NK细胞，在体外经扩大培养。但外周血淋巴细胞中NK细胞比例较低（仅5%-15%），冻存后NK细胞产量降低和毒性损失。
B、永生化NK细胞系：目前建立的NK细胞系有NK-92，YT、NKL、NK101等多种细胞系，NK-92是FDA批准可用于Ⅰ、Ⅱ期临床试验的唯一NK细胞系，体外易培养、易改造，但作为恶行细胞系输注前必须经过辐射减轻体内成瘤风险，这也限制了其在体内的增殖和持续时间。
C、原代UCB-NK来源的NK细胞：脐带血中NK细胞比例较高（约23%），且NK细胞为HLA单倍型，允许生成一个细胞库，根据需要选择HLA不同匹配度的NK细胞，但NK细胞成熟度较低，细胞毒性较弱。
D、干细胞来源的NK细胞：从人类胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(诱导PSC)产生临床治疗规模NK细胞，可行性已被证实。干细胞来源的NK细胞具有多能性、可长期储存，同一克隆来源的细胞均一性强。但iPSC来源的细胞总是具有恶性转化的潜力和一定的免疫原性。
2.NK细胞的免疫分型检测
如图所示，以外周血PBMC为例，在早期研究中常用CD3-CD56+确定NK细胞，随着对NK细胞研究的深入，研究人员更倾向于把NK细胞定义为CD3-CD14-CD19-CD56+细胞，而CD56+细胞又可以进一步分为CD56+CD16-NK和CD56+CD16+NK两个亚群。
3.NK细胞功能分析
对NK细胞功能的分析主要是分析其细胞毒性潜能，包括在不同刺激因素（靶细胞K562、抗体介导ADCC效应、细胞因子IL12/IL18）活化下的脱颗粒现象（基于CD107a表达变化评估）及相关毒性分子（Perforin、Granzyme B、IFN-r、TNF-a）的表达。
