想要WB实验不翻车？这几个冷门知识必须掌握

Part.1 WB理论先行

蛋白质印迹( Western Blotting ) 这个经典的蛋白研究方法，几乎是生物实验室必学的第一个实验，不过才40年历史。

也许年轻的你觉得40年历史的WB已是老古董了，那么一个热知识送给你，智能手机也仅有30年历史。年轻的WB就像老庄的蝴蝶，时而信号弱时而背景高，就让我们来聊聊这个“玄学”吧！

转印膜

误区1：

学霸师兄只用0.45um的PVDF膜，所以本学渣也不用0.2um的PVDF膜，主打一个无脑跟风。

那些师兄没告诉你的事：

蛋白与膜的结合贯穿整个膜的厚度（深度），所以结合能力是由孔的内部表面积来决定的（Mansfield，1994）。0.2um PVDF膜的内部表面积约是0.45um PVDF膜的三倍，即前者吸附能力更高。下表所列数值代表了膜表面积在非变性缓冲液中饱和后蛋白结合的上限。在任一指定的应用中，都可以预期0.2um膜能结合更多的蛋白。

下图可验证两种孔径的PVDF膜之间的结合差异。部分蛋白穿过0.45um膜，被第一张膜后面的第二张膜所捕获。相比之下，所有蛋白与0.2um膜结合而未穿过。因此，如果分析较小的蛋白（分子量＜20kDa），或必须捕获100%的蛋白进行肽段测序，则首选0.2um膜。

▲图注：第5、6泳道在0.45um膜后面，第7、8泳道在0.2um膜后面

缓冲液

误区2：

实验室的缓冲液一配就配一车，仿佛能用到本懒汉做完实验

那些师姐没告诉你的事：

尽管常见的缓冲液系统适用于大多数蛋白质转印，但文献中包含许多变化，适用于不同的应用。这里举个例子：

（1）在蛋白测序应用中，建议使用10mM CAPS缓冲液（pH 11）（Ma-tsudaira，1987）。Towbin缓冲液中使用的甘氨酸及凝胶电泳缓冲液中残留的甘氨酸会导致Edman原理的自动蛋白测序结果中出现高背景。通过改变缓冲液的配方，这种假象显著减少。

（2）添加在缓冲液中的甲醇主要有两个功能，稳定凝胶的尺寸和从蛋白分子上解离出SDS。添加到缓冲液中的甲醇能最大限度地减少凝胶溶胀，而转印操作的平衡步骤目的也是达到凝胶尺寸的稳定。当甲醇浓度为10-20%时，尺寸稳定性可快速实现；当甲醇浓度较低时，平衡需要更长的时间。对于在甲醇中溶解度有限的高分子量蛋白，减少甲醇可明显提高蛋白转移效率。

磷酸化蛋白检测

误区3：

这是WB 检测中的Hard模式，比我的人生还Hard，做不做的出来全看缘分

那些你需要给自己打气的事：

蛋白磷酸化，是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸残基上添加磷酸基团的一种可逆的翻译后修饰，也是信号转导研究绕不开的话题。蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，一旦细胞裂解，就会释放出蛋白酶和磷酸酶，可以降解或修饰蛋白质，从而影响检测结果。听起来很难？其实细节做到位，WB就不会Welcome Back（让你再来一次）！

WB实验口诀送给大家：

取样迅速别墨迹，样品操作在冰上；

洗涤细胞要预冷，新鲜配制裂解液；

双抑制剂莫忘加，煮不煮沸看位点；

收集变性即分装！

Part.2 WB实验至上

如何优雅地完成WB实验？这里给大家提供一个十分可行的答案：选择大于努力——选对象，选方法，一个道理！

在传统WB实验中，封闭、抗体孵育和清洗步骤需要4-24小时。这里介绍一种优雅地方法，只需30分钟，而且不会损失信号强度或降低印迹质量，助你成为一位看起来“毫不费力的学霸”。

传说有一种真空驱动系统，试剂被“拉”过膜，增加了试剂与膜内部的接触，与传统的缓慢扩散和摇动相比更加有效。这种改良的三维试剂分布可减少免疫检测所需要的时间，蛋白转移到膜上之后的所有免疫检测步骤（即封闭、清洗及一抗和二抗孵育）都可在这个神奇的系统上进行。省下的时间肝文章不香吗？不睡觉只会垮掉，高效的方法才能让一天变48小时。

操作方法即：

电泳分离→转印→神奇系统（30min）→显色/检测