细胞转染之质粒转染的玄机
实验宝典拿在手 质粒转染三步曲
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去内毒素提取质粒DNA
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的特有成分，在质粒提取过程中很容易一同提取出来，它会导致许多细胞系中的毒性大和转染效率降低。所以需要使用低内毒素或无内毒素的质粒提取试剂盒，以保证细胞转染结果。
这里必须推荐一下赛默飞PureLink™ 快速低内毒素质粒纯化试剂盒：快速简便30分钟内完成纯化，可提供高达0.4 mg（中量提取）和高达1.5 mg（大量提取）的质粒。
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选择合适的转染试剂
Polyplus转染试剂是基于阳离子聚合物PEI的转染方法，与脂质体相比，具有更高转染效率，更低细胞毒性，更简操作步骤，更省实验成本。让您的转染实验功力大增，快速达到想要的实验结果。jetPRIME在HeLa、HEK-293、CHO等普通细胞中可达70-90%的转染效率。
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质粒转染实验指南
细胞接种
使用jetPRIME进行转染时，细胞融合度需要在60-80%。注：如果细胞状态差，融合度过高或过低，都建议重新接种细胞。
举例：基于 6 孔板的操作，转染前 24 小时，接种200，000 个细胞，2mL 细胞悬液。（其他具体培养条件，请参考表1）
表1. 转染前建议细胞接种量
注意：jetPRIME® 在血清和抗生素的条件下非常稳定，因此，转染实验可以在有血清和抗生素的条件下进行。
质粒转染操作流程
细胞复苏后传代 2-3 代再进行转染操作流程举例。以下为在 6 孔板中的实验操作，参照数字都是每孔使用量：
①将 2ug DNA 加入到 200uL 的 jetPRIME 缓冲液中（产品附带）。注：不需要使用 Opti-MEM；
②立即涡旋轻轻混2-3s并顺离，或者上下颠倒4-5次并轻甩。注：不建议用枪头吹打或手弹；
③加入 4uL jetPRIME，立即涡旋混匀 2-3s 并顺离，或者上下颠倒4-5次并轻甩。注：不建议用枪头吹打或手弹；
④室温下孵育 10 min，形成转染复合物。注：不建议延长或缩短时间；
⑤将 200uL 的转染复合物滴加到含有血清的细胞中；
⑥轻轻摇动培养器皿以使转染复合物均匀的分布到细胞中 ；
⑦jetPRIME转染试剂可兼容血清和抗生素，转染前后不用换液。如有需要或者敏感细胞，转染后 4 小时可换培养基；
⑧转染 24 小时后或根据经验分析结果。
表2 DNA 转染参照表
表中参照数字都是每孔使用量
标准条件： DNA:jetPRIME=1:2 (W/V)， 即 1ug DNA 使用 2uLjetPRIME
注意：请使用 jetPRIME缓冲液来稀释 DNA；请完全按照操作说明书上体系和操作条件来做实验；
提高质粒转染效率的秘诀
1）使用去除内毒素的高质量质粒，不含蛋白或 RNA (OD260/280>1.8)。
2）质粒的浓度建议在 0.3-1 ug/uL。
3）优化 DNA 和 jetPRIME转染试剂用量：如细胞状态好，首先考虑增加 jetPRIME转染试剂用量。如转染效率未明显提高，则增加 DNA 用量。
4）对于难转染细胞，则起始 DNA 用量增加到表 2 中建议的 1.5 倍。如观察到细胞毒性，则降低 DNA 用量。
5）使用带有报告基因的质粒，例如有荧光素酶或 GFP 标记的阳性对照。
6）确保转染操作时，细胞在含有血清的条件下培养。缺乏血清时，细胞状态不佳，则转染会受影响。
7）确保使用 jetPRIME缓冲液来稀释核酸。
降低细胞毒性的秘诀
1）确保质粒无内毒素。（普通细胞转染建议质粒内毒素水平<1EU/ug；原代等敏感细胞转染建议质粒内毒素水平<0.1EU/ug）
2）转染后 4 小时换液。
3）确保使用 jetPRIME缓冲液来稀释核酸。
4）如果质粒表达的蛋白对细胞有毒性，则降低 DNA 用量。
5）减少 jetPRIME转染试剂用量。
6）转染后 24 小时检测转染效率。
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