关于“细胞自噬”，看这个系列就够了(2)
本周干货：细胞自噬的检测方法
上篇文章给大家介绍了细胞自噬的基本概念、过程以及自噬的特性（点这里查看）。
相信大家对自噬有了初步的了解，那么今天就带大家了解一下自噬的检测方法，让我们更好的发现、观察自噬。
Part.01
电镜检测
自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法：
▲隔离膜
▲单箭头：自噬小体；双箭头：自噬溶酶体；
Part.02
双荧光穿梭质粒系统检测
自噬形成时，mRFP-GFP-LC3质粒转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。
当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光；
表达mRFP-GFP-LC3的小鼠胚胎成纤维细胞（左）接受饥饿处理（2小时），其中（右）或（中）不添加100 nM巴菲霉素A1（抑制自噬小体/溶酶体融合）。
中间的黄色（自噬小体）和红色（自噬溶酶体）斑点都增加了，而右边的大多数斑点都是黄色的（自噬小体）。
Ref：
1.Following autophagy step by step 《BMC Biol》doi: 10.1186/1741-7007-9-39；
2.Methods in Mammalian Autophagy Research 《Cell》doi: 10.1016/j.cell.2010.01.028
Part.03
单荧光质粒系统检测
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：
无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；
自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
Ref: Autophagic flux disruption contributes to Ganoderma lucidum polysaccharide-induced apoptosis in human colorectal cancer cells via MAPK/ERK activation 《Cell Death Dis》 doi: 10.1038/s41419-019-1653-7
Part.04
WB检测
LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。LC3亚型有：LC3A、LC3B和LC3C。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。
自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用。
以上就是自噬的主要检测方法，了解了这些，就能更好的帮助我们观察自噬！
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