传统肝脏灌流法难度大？这2款解决方案更适合您！

本期关键词：获取原代肝脏细胞的解决方案

目前制备原代肝实质细胞的标准方法是传统肝脏灌流，但操作起来时常面临诸多难题。本文将基于肝脏单细胞的研究，为大家提供2款比较合适的解决方案。

肝脏组成细胞复杂性与异质性

肝脏是人体发挥代谢与免疫功能的重要器官，由实质细胞和非实质细胞组成。

其中实质细胞的占比达70%-80%，包括肝细胞和少量的胆管内皮细胞；非实质细胞占比达20%-30%，包括星状细胞，巨噬细胞，NK细胞，成纤维细胞等。

【肝细胞与胆管细胞】

基于单细胞测序分析的方法，在转录层次对肝脏干细胞的特征有所刻画，如：AFP+的肝细胞在参与细胞分裂和IL-6信号通路中富集；胆管细胞表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)，在进一步分析EpCAM+细胞群体时，发现EpCAM+细胞包括成熟的胆管细胞、肝细胞偏置群体(ASGR1+)和幼稚祖细胞群体，分别在肝脏再生中发挥不同作用。

【肝脏内免疫细胞】

Kupffer 细胞即肝巨噬细胞，在清除肠道源性病原体和受损的红细胞，调节铁和脂质代谢，维持免疫耐受，感知组织损伤发挥作用。基于多个独立的人肝脏scRNAseq研究均发现人Kupffer细胞为CD163+ MARCO+ CD5L+ TIMD4+ 巨噬细胞的突变。

NK细胞与肝损伤和纤维化的发病机制有关，使用scRNAseq在纤维化的人肝组织中观察到CD56+CD16 NK细胞亚群的丢失。

【肝脏内皮细胞】

肝窦内皮细胞（LSEC）在肝内主要通过与免疫细胞形成紧密连接后在肝脏内部迁移的方式，参与对可溶性抗原的免疫反应，具有较强的抗原摄取、水解的功能。肝损伤除引起肝血管的实质性变化，也造成肝窦细胞（LSEC）玻璃孔的丢失和有组织的基础膜的形成。这种LSEC毛细血管化被认为在纤维形成中起关键作用，部分是通过抑制星状细胞激活。

【肝间充质细胞】

间充质细胞在肝脏中异质分布，肝损伤后，间充质细胞在肝脏疾病的发病过程中起关键作用，是肝纤维化过程中致病性细胞外基质的主要来源。因此，它们作为潜在的抗纤维化治疗靶点引起了广泛的兴趣。

肝脏组织内细胞分离困难

获得健康人肝脏单细胞水平的数据信息，对了解肝脏疾病发展、开发肝脏疾病的治疗与预防药物具有重要指导意义，特别考虑到我国是肝病大国的现状。

然而，这种宏观概括数据难以获得的主要原因在于肝脏组织内细胞的分离。肝脏由于自身的特殊性质，属于极难进行解离的组织类型，造成解离困难的原因众多：

● 肝脏的基本结构单位组成复杂，两侧肝窦内皮细胞包裹肝实质细胞形成三明治结构，实质细胞内部有大量管状结构贯穿；

● 肝脏代谢旺盛，离体后无法正常进行有氧糖酵解，供能不足导致细胞活力迅速下降；

● 肝细胞和胆管细胞解离过程中极易破碎并释放大量酶类，进一步加剧细胞破损的情况；

● 肝脏内多种细胞性质差别较大，难以在单一解离条件下获得所有细胞类型，这也是肝脏解离后通常出现大量碎片的重要原因。

因此，从实验可操作性及成功率的角度考虑，基于肝脏单细胞的研究应选择最适的解离方案。

传统肝脏灌流方法的常见问题

对于从事病毒性肝炎、肝硬化、肝癌以及遗传性代谢疾病、免疫性肝病、药物和化学中毒性肝病、肝血管性疾病等等等等等的科研同学们来说，原代肝实质细胞是研究体外药物毒性、代谢和药代动力学的标准细胞培养模型，目前制备原代肝实质细胞的标准方法是传统肝脏灌流，但确面临诸多难题：