免疫荧光染色结果总是不理想？多半是因为……

免

Q1

这种成像情况大多是曝光过度!过度曝光的原因是曝光时间是不合适的。

我们的荧光染料强度比一般染料强，不易淬灭。一般在曝光时间3-5ms即可获得荧光信号，最长不超过20ms。你可以看一下显微镜/扫描仪的曝光时间，如果曝光时间过长，整个片子都会有荧光信号。

如果你没有手动设定曝光时间，曝光的是仪器自动的，那么出现这种情况很有可能是你的阳性信号太弱，仪器在短时间的曝光时间内没有信号，所以自动延长曝光时间来拍摄，很有可能背景被严重曝光。

可以尝试手动调整曝光时间，缩短时间背景微弱但阳性信号也弱，还需要调整抗体浓度和抗体孵养时间;如果缩短后的背景仍然很强，请确认染料的孵育时间是否过长，我们最长的染料孵育不要超过10分钟，3-5分钟甚至已经孵育出信号，时间过长片都会发生信号。

Q2

这种情况因为这个位置组织坏死了或者没有足够的清洁，导致这个地方可能有大量的蛋白质碎片或者组织液，或者血液，这些杂质可能是我们的TSA，染料大量沉积，导致这些位置出现较强的非特异性。

所以我们在取材料的时候，要尽量避免坏死区域，也可以灌注清洗，这些预处理也要做好，样品的质量决定了最终染色的质量。

一个小经验分享给大家：血细胞容易对短波长的染料吸附，如果有些样品没有办法灌注清洁，可以考虑避开这些染料

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