人外周血中性粒细胞分离与流式检测方法

近期，STAR Protocols 期刊在线发表了“Protocol for density gradient neutrophil isolation and flow cytometry-based characterization from human peripheral blood”的方法文章。

中性粒细胞是细菌或病毒感染的第一免疫反应者，在宿主免疫反应中发挥关键作用；然而，处理和研究新鲜的中性粒细胞可能是具有挑战性的。在这里，作者提出了一种人外周血中性粒细胞分离与流式检测方法。

PROTOCOL

实验方案

Part.1/ 抗体信息

Part.2/ Neutrophil isolation

从10 mL血液开始的双梯度Percoll分离法从人血中分离中性粒细胞。数量可以根据样品的供应情况进行调整。

1. 10 mL75% Percoll 加入50 mL离心管中，再加入10 mL 62% Percoll。

2. 用10 mL不含抗生素的无血清RPMI1640将10 mL新鲜血液1：1稀释，小心缓慢加到 62% Percoll上，一共40 mL体积。

3. 分别以200 g/25 min 和400 g/15 min离心

4. 收集75%至62% Percoll层之间的中性粒细胞至另一个50 mL离心管中（图1）。

5. 加入RPMI1640洗一次，300 g/5 min离心。

6. 弃上清，加入1 mL neutrophil buffer。

图1 人外周血PBMC中性粒细胞样本制备

Part.3/ Cytospin and staining

Part.4/ Antibody titration

这里作者做了一个抗体滴定，具体的操作步骤大家可以看一下文章原文：

1. 96孔U型底板中，每孔0.5–1 × 106/100 μL neutrophil buffer。

2. 4℃，300 g/ 5 min离心。

3. 弃上清，加入200 μL FACS buffer。

4. 4℃，300 g/ 5 min离心。

5. 弃上清，加入100 μL FACS buffer 和 Fc Block (diluted 1:100 in FACS buffer)，冰上或者4℃孵育20 min。

6. 4℃，300 g/ 5 min离心。

7. 弃上清，加入100 μL FACS buffer重悬。

8. 在每孔100 mL的FACS buffer中分别加入5 μL、2 μL或1 μL的抗体，滴定每个抗体。

9. 4℃避光孵育30 min。

10. 4℃，300 g/ 5 min离心。

11. 弃上清，200 μL FACS buffer洗。

12. 4℃，300 g/ 5 min离心。

13. 弃上清，200 μL FACS buffer重悬上机。

Part.5/ Neutrophil staining for flow cytometry

1. 96孔U型底板中，每孔0.5–1 × 106/100 μL neutrophil buffer。

2. 4℃，300 g/ 5 min离心。

3. 弃上清，加入200 μL FACS buffer。

4. 4℃，300 g/ 5 min离心。

5. 弃上清，加入100 μL FACS buffer 和 Fc Block (diluted 1:100 in FACS buffer)，冰上或者4℃孵育20 min。

6. 4℃，300 g/ 5 min离心。

7. 弃上清，加入100 μL FACS buffer重悬。

8. 根据滴定结果加入相应抗体染色，4℃避光孵育30 min。

9. 设置FMO组。

10. 4℃，300 g/ 5 min离心。

11. 弃上清，200 μL FACS buffer洗。

12. 4℃，300 g/ 5 min离心。

13. 弃上清，200 μL FACS buffer重悬上机。

图2圈门策略

参考文献：

Kuang Y, Parthasarathy U, Martinelli R. Protocol for density gradient neutrophil isolation and flow cytometry-based characterization from human peripheral blood. STAR Protoc. 2023 Aug 16;4(3):102497. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102497. Epub ahead of print. PMID: 37590147; PMCID: PMC10461015.