人外周血中性粒细胞分离与流式检测方法
近期,STAR Protocols 期刊在线发表了“Protocol for density gradient neutrophil isolation and flow cytometry-based characterization from human peripheral blood”的方法文章。

中性粒细胞是细菌或病毒感染的第一免疫反应者,在宿主免疫反应中发挥关键作用;然而,处理和研究新鲜的中性粒细胞可能是具有挑战性的。在这里,作者提出了一种人外周血中性粒细胞分离与流式检测方法。
PROTOCOL
实验方案

Part.1/ 抗体信息

Part.2/ Neutrophil isolation
从10 mL血液开始的双梯度Percoll分离法从人血中分离中性粒细胞。数量可以根据样品的供应情况进行调整。
1. 10 mL75% Percoll 加入50 mL离心管中,再加入10 mL 62% Percoll。
2. 用10 mL不含抗生素的无血清RPMI1640将10 mL新鲜血液1:1稀释,小心缓慢加到 62% Percoll上,一共40 mL体积。
3. 分别以200 g/25 min 和400 g/15 min离心
4. 收集75%至62% Percoll层之间的中性粒细胞至另一个50 mL离心管中(图1)。
5. 加入RPMI1640洗一次,300 g/5 min离心。
6. 弃上清,加入1 mL neutrophil buffer。

图1 人外周血PBMC中性粒细胞样本制备
Part.3/ Cytospin and staining

Part.4/ Antibody titration
这里作者做了一个抗体滴定,具体的操作步骤大家可以看一下文章原文:
1. 96孔U型底板中,每孔0.5–1 × 106/100 μL neutrophil buffer。
2. 4℃,300 g/ 5 min离心。
3. 弃上清,加入200 μL FACS buffer。
4. 4℃,300 g/ 5 min离心。
5. 弃上清,加入100 μL FACS buffer 和 Fc Block (diluted 1:100 in FACS buffer), 冰上或者4℃孵育20 min。
6. 4℃,300 g/ 5 min离心。
7. 弃上清,加入100 μL FACS buffer重悬。
8. 在每孔100 mL的FACS buffer中分别加入5 μL、2 μL或1 μL的抗体,滴定每个抗体。
9. 4℃避光孵育30 min。
10. 4℃,300 g/ 5 min离心。
11. 弃上清,200 μL FACS buffer洗。
12. 4℃,300 g/ 5 min离心。
13. 弃上清,200 μL FACS buffer重悬上机。

Part.5/ Neutrophil staining for flow cytometry
1. 96孔U型底板中,每孔0.5–1 × 106/100 μL neutrophil buffer。
2. 4℃,300 g/ 5 min离心。
3. 弃上清,加入200 μL FACS buffer。
4. 4℃,300 g/ 5 min离心。
5. 弃上清,加入100 μL FACS buffer 和 Fc Block (diluted 1:100 in FACS buffer), 冰上或者4℃孵育20 min。
6. 4℃,300 g/ 5 min离心。
7. 弃上清,加入100 μL FACS buffer重悬。
8. 根据滴定结果加入相应抗体染色,4℃避光孵育30 min。
9. 设置FMO组。
10. 4℃,300 g/ 5 min离心。
11. 弃上清,200 μL FACS buffer洗。
12. 4℃,300 g/ 5 min离心。
13. 弃上清,200 μL FACS buffer重悬上机。

图2圈门策略
参考文献:
Kuang Y, Parthasarathy U, Martinelli R. Protocol for density gradient neutrophil isolation and flow cytometry-based characterization from human peripheral blood. STAR Protoc. 2023 Aug 16;4(3):102497. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102497. Epub ahead of print. PMID: 37590147; PMCID: PMC10461015.

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