流式实验总做不好？这份「高频常见问题 解决思路」收好！

1. 无信号/荧光强度弱 

● 补偿问题

多色流式配色很关键，低表达的抗原可以用相同荧光素的高表达抗原代替，或者使用补偿微球。

● 用于检测的抗体不足

一定要做抗体滴定，按照说明书的要求加抗体。

● 无法接近细胞内靶标

确定好抗原的表达位置，选择合适的染色方法和刺激方法。

● 激光器未对齐

做实验前一定要确保仪器没有问题。流式细胞仪是流式的三大基本要素之一，要经常维护仪器，做质控，并清洗仪器。确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微珠来调整路线。如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器。

● 靶蛋白不存在/低水平表达

确保您正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被检出。

● 细胞因子类marker

正常的淋巴细胞处于未激活状态，不会分泌细胞因子。因此要选择合适的方法激活淋巴细胞，使其释放细胞因子，达到检测水平。同时要加蛋白转运抑制剂使其留在胞内，然后固定破膜，染相应抗体。细胞刺激剂、蛋白转运抑制剂以及固定破膜的试剂的选择都会影响染色结果。

● 荧光淬灭

抗体可能存放太久或没有避光。还要考虑固定试剂的问题。

● 一抗和二抗不匹配

使用的二抗应与一抗来源种属不同（例如，一抗为兔源，则应该使用抗兔源二抗）。为了解决种属交叉反应性的问题，您可以使用经流式细胞术验证的直接偶联一抗，或者使用偶联物试剂盒，在您选择的抗体中加入合适的荧光染料。

2. 荧光强度高

● 抗体浓度过高

做抗体滴定。

● 过量抗体被捕获

胞内染色特有的问题。染色后，充分清洗。也有可能是破膜剂的问题，破膜不够充分。

● 无法接近细胞内靶标

确定好抗原的表达位置，选择合适的染色方法和刺激方法。

● 封闭不足

做Fc受体阻断是一个特别好的流式习惯，但不是所有的细胞都需要做封闭，做封闭是为了减少非特异性结合。

3. 背景高/阳性细胞百分比高

● 增益设置过高/补偿过低

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，使用补偿减少小颗粒背景信号并减少增益，以降低信号。

● 抗体过量

抗体滴定。清洗充分。

4. 在应该只有1个细胞群时观察到2个或以上

● 表达目的marker的细胞群不止一个

做实验前要确定好目的细胞的目的marker。

● 出现细胞双峰

细胞双峰显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。制样和上机的过程要确保是单细胞悬液，并且过滤掉大的组织团块。

一定要做抗体滴定，按照说明书的要求加抗体。

5. 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

● 细胞裂解

制样问题，保证细胞的活力，不能有太多碎片。注意离心条件和涡旋力度。

● 细菌污染

确保样本不受污染。细菌会自动发出较弱的荧光，导致高事件率。

● 去死活

样本制备不可避免的会出现细胞死亡或坏死，特别是实体组织制备的单细胞悬液，一定要染死活，不染自发荧光会很高，干扰实验结果。

6. 其他

● 细胞量

正常1×106个细胞/100 μL体系中染色。表达量高的膜表面分子可以体系减半抗体减半。固定破膜的过程中，会损失掉一些细胞。因此，表达量低、胞内、核内分子可以加大细胞量，相应体积的抗体也可以对应细胞量多加，一定要做预实验和抗体滴定，摸索最佳染色效果。

● 电压

裸细胞调完FSC、SSC的电压，记得调荧光通道的电压。

● 对照

一定要设置好对照组，补偿对照、阴性对照、阳性对照（生物学对照）、同型对照、FMO对照。

● 细胞聚集，阻塞管道

制样的过程中一定要确保是单细胞悬液，制样和上机的时候过滤掉组织团块。

● 固定

某些荧光素对多聚甲醛敏感，要注意，可以选择成品、温和的固定液。如果固定过夜，上机前要清洗掉多聚甲醛再上机。

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