小鼠肠道固有层淋巴细胞的流式分析
肠道免疫系统主要由肠道菌群、肠道免疫细胞和肠道黏膜屏障等组成。其中肠道固有层发现了包括巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞等在内的免疫细胞。
肠道免疫研究火热，但想要制备高细胞活力的肠道免疫细胞样本有一定的难度。今天给大家介绍一种小鼠肠道固有层淋巴细胞的分离与流式分析方法，此方法发表在STAR Protoc上。
实验用buffer
STEP1-2 取材、样本制备
01
实验用鼠
-
8–12周雌雄 C57BL/6 小鼠
02
方法
-
取材
麻醉处死小鼠——解剖小鼠——取肠——放入含有预冷的5 mL HBSS（不含Ca2+，Mg2+）的孔板中（在HBSS中添加2%的胎牛血清可提高细胞活力）——剥离脂肪组织和Peyer's斑块、去除肠道内容物——样本放入预冷的HBSS中清洗两次，并通过轻轻擦洗来清除粘液（尽量去除粘液）——转移至新的含有预冷的5 mL HBSS（不含Ca2+，Mg2+）的孔板中。
取材过程
-
制样
A.【去除上皮细胞和上皮内淋巴细胞】
①50 mL离心管中提前加入15 mL的EDTA-DTT buffer，预热至37℃；
②将样本放入离心管中并被EDTA-DTT buffer完全覆盖；
③将离心管以45度角放于37℃的摇床中（250 rpm/15 min）；
④最大速度剧烈涡旋（3000 rpm/10 s）；
⑤提前准备2个培养皿，并加入20 mL冰冷的RPMI-1640培基；
⑥将组织从EDTA-DTT缓冲液中取出，用干净的吸水纸擦干残留的溶液；
⑦用冰冷的RPMI-1640培养基冲洗组织，然后用吸水纸擦洗。重复此步骤。
特别提示：如果上皮细胞或上皮内淋巴细胞是所需的分析群体，可以用EDTA（用于肠上皮细胞）和DTT（用于上皮内淋巴细胞）缓冲液分别处理，每次处理后保存上清液。
B.【分离固有层淋巴细胞】
①50 mL离心管中提前加入5 mL的 digestion solution（现配现用，37℃预热RPMI-1640），并将组织转移至此管；
②将离心管以45度角放于37℃的摇床中（250 rpm/40 min-1 h），每15min剧烈摇晃一次，以提高消化效率（小肠消化35 min，大肠消化50 min）；
③将消化好的细胞悬液通过100 μm滤器过滤至新的50 mL离心管中，去掉部分组织团块，并且用15 mL冰冷的HBSS将原来的50 mL离心管冲洗干净并过滤至新的管子中；
④离心细胞悬液（450g/10 min，4℃），弃上清；
⑤使用Percoll分离液分离出淋巴细胞，860 g /20 min，21℃ （lowest acceleration speed (acceleration 0 or 1) and no brake (deceleration 0)），小心吸取细胞。
⑥加入10 mL HBSS，4℃，450 g/10 min，弃上清；
制样过程
Step3-4 流式分析
-
区分死活
-
Fc受体阻断
-
表面抗体
-
膜内、核内抗体
-
圈门思路
FSC-SSC物理图
去黏连（2次）
B cells：AmCyan-CD45+TCRβ-CD3e-CD19+
非αβ T cells (γδ T cells)：AmCyan-CD45+TCRβ-CD3e+
CD8+ T cells：AmCyan-CD45+TCRβ+CD3e+CD19-CD4-CD8+
CD4+ T cells：AmCyan-CD45+TCRβ+CD3e+CD19-CD8-CD4+
Th1/17/Treg cells：IL-17A/IFN-γ/RORγt+FoxP3+
流式分析
免费领取肠上皮淋巴细胞分离与培养
除了肠道固有层淋巴细胞，有的老师也会关注到肠上皮淋巴细胞，具体的样本制备和培养方法欢迎大家扫码留咨获取！
参考文献
Kim E, Tran M, Sun Y, Huh JR. Isolation and analyses of lamina propria lymphocytes from mouse intestines. STAR Protoc. 2022 May 6;3(2):101366. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101366. PMID: 35573483; PMCID: PMC9097554.
加入社群
关于福麦斯
