凋亡实验限免活动！附：6个细胞凋亡检测常见问题

为什么凋亡结果与预期不符？

处理时间过长，处理浓度过高，细胞初始活性差等原因导致的假阳性或假阴性结果。

假阳性问题如何解决？

1）对贴壁细胞而言，消化是最关键的步骤，消化液需用不含 EDTA 的胰酶，因为 Annexin V 和 PS 的结合需要 Ca2⁺，而 EDTA 是 Ca2⁺ 螯合剂，使用含有 EDTA 的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中在孵育 30min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞保存在含 2% BSA 的 PBS 中，防止进一步的损伤。

这里推荐一下福麦斯的Accutase消化液，#FMS-AT300（后文会有详细介绍）。

2）神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。

其他操作过程常见问题

1）液氮保存的组织块，不建议再做流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。液氮保存的组织块，可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

2） Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。

3）如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。

4）操作中务必动作轻柔，离心后确认管底是否有细胞，经常有人液体一甩，细胞也给甩走了。操作中还要注意避光。

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