还在混淆IHC/ICC/IF/mIHC？手把手教学：实验全流程、常见问题详解！
因为原理相似，实验新手在面对IF、ICC、IHC、mIHC这几种技术时总是非常困扰，技术大神也会在写文章时不小心混淆。
理清各种实验技术非常重要！我们会分2期内容，全面解析这4种免疫学常用技术的特点、实验步骤和常见问题。
本期关键词：免疫荧光、免疫细胞化学
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如何区分IF、ICC、IHC、mIHC
首先，我们需要明确免疫学中经常看到的这几个简写具体是什么意思：
▲免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光2类；而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。因此才会延伸出3个相近的概念。
也可以根据英文词根进行分析：
免疫组织化学：Immunohistochemistry (IHC)；
免疫细胞化学：Immunocytochemistry (ICC) ；
免疫荧光：Immunofluorescence (IF)；
当然，近几年常被提到的还有多重免疫组化：Multiplex immunohistochemistry(mIHC)。
▲多重荧光免疫组化技术（mIHC）是一种免疫组化（IHC）技术的进化版本，它介于IHC和IF（免疫荧光）之间。与传统的IHC和IF技术相比，其优势主要在于可以同时检测多种蛋白质、分子或细胞标志物并生成高分辨率图像。
IF、ICC原理解析
显色方式不同是免疫化学、免疫荧光最大的区别：
免疫荧光（IF）是二抗偶联荧光基团经过激发显色；
免疫细胞化学（ICC）通过化学反应显色；
免疫荧光（IF）利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析；由于特异性强、敏感性高、速度快，广泛用于科学研究。
▲免疫荧光（IF）的检测方法主要包括直接免疫荧光和间接免疫荧光。
免疫细胞化学 (ICC)通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
因为ICC/IF的原理和实验步骤大致相同，所以常常把 ICC/IF放在一起使用。
实验步骤拆解
标准的ICC/IF实验方案包括：样本制备→染色前的固定/透化/封闭/→抗体孵育→复染&显微镜成像。
影响实验效果的关键点
1）设置对照：可以使用阳性和阴性对照来确定结果的准确性，并帮助确定任何问题的来源；
2）清楚蛋白定位和预测蛋白表达；
3）细胞爬片时的密度；
4） 一抗浓度和特异性好坏；
5） 如果涉及到双标染色，切记要将两种蛋白的种属来源区分开，二抗的颜色也要区分开；
6） DAPI复染时间；
7） 如果要观察时间梯度的变化，尽量不用一次性观察好几个时间组，一次只观察1-2组，不会影响荧光效果。
Step1
样本制备
样本前处理：细胞爬片
◆ 洗涤：弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温PBS清洗2次，每次5分钟；
◆ 固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液，置于4℃，固定15分钟；固定液需足量；
◆ 洗涤：去除固定液，使用4℃预冷的PBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
◆ 透膜：含有0.3%TritonX-100的PBS室温孵育20分钟。
该操作注意事项
1）需避免实验操作时温差过大或温度骤变；
2）固定液需保证足量，可过量使用；
3）甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作；
4）关注细胞密度，是整个实验成功的关键之一；
▲左图细胞密度正好，右图细胞太密了
正常的细胞密度在60-70%，这样在显微镜下可以看清每个细胞的形态。镜下细胞太多反而会让图像效果很乱，没有针对性；如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果。
实操中可以参考以下3点：
①保证玻片上的细胞以单细胞层生长；
②充分考虑细胞生长的速度；
③保证爬片是无菌的。
样本前处理：石蜡切片样本
◆ 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片3min；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
◆ 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再从恒温箱中取出两者置于常温；5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3（也可以选择梯度浓度乙醇）的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5min；最后用流水清洗切片5min；
◆ 抗原修复：在高压锅中，加入抗原修复液高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2min；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
该操作注意事项
1）流水清洗时水流不能直接对着切片；
2）操作过程中需保持切片一直处于湿润状态；
3）修复液需完全浸没切片上的组织；
4）修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；
5）修复完成后，避免快速冷却；
6）修复液可根据实验需求自行选用修复液。
样本前处理：冰冻切片
◆ 样本在OCT包埋液中进行速冻；
◆ 冰冻块固定在组织卡盘（chuck）中，并固定在切片组件上；
◆ 切片厚度为10-20μm，逐片收集；
◆ 擦去多余的OCT，用组化笔勾画组织的疏水边界。切片晾干10-15min，以防止切片在后续洗涤步骤中脱片。
▲冰冻切片制备过程中常见问题汇总
Step2
染色步骤
固定
◆ 目的：为了保持细胞的完整性和抗原的活性，以便进行后续的抗体结合和荧光检测。
固定液：主要分为2种，有机溶剂（比如：甲醇、乙醇、丙酮）；交联剂（比如：4%PFA、10%中性福尔马林）；
◆ 固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
◆ 以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。
该操作注意事项
1）固定液怎么选：
取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
如果一种固定液做不出来可以试试其他固定液：
多聚甲醇有时会封闭一些抗原结合位点；甲醇固定、丙酮的固定效果都还不错。
▲甲醇固定 VS 4% 多聚甲醛效果对比
上图：甲醇固定，下图：4% 多聚甲醛
通透
◆ 目的：是使抗体进入胞内；
◆ 0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；
◆ 除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。
该操作注意事项
1）有些抗体说明书会特别提醒做荧光时的通透处理方式，建议仔细阅读，避免特殊要求漏看。
封闭
◆ 目的：减少一抗和二抗与非特异位点进行结合。
◆ 通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。
◆ 常用的封闭液：与二抗同一来源的血清、BSA、羊血清。
该操作注意事项
1）从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品保湿，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景。
2）醛类固定的样品，在用一抗孵育前，需要用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。
一抗孵育
◆ 根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。
◆ 回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5min，共洗涤3次
该操作注意事项
1）选择一抗需要参考以下3点：
产生一抗的来源种属与要检测的种属不同；
一抗是否能与目标蛋白结合？
是否曾证实一抗在您的应用中有效？
2）关注抗体浓度：最佳或最优的抗体工作浓度可以使特异性染色最大化并减少背景。建议从产品说明书推荐的起始浓度进行尝试。
二抗孵育
◆ 化学显色与荧光检测：可以选择化学显色法（ICC），使用酶标记的二抗，也可以选择荧光法（IF），使用荧光染料标记的二抗进行检测。
荧光法（IF）注意事项
一般来说，荧光二抗是第一选择，所以对于带有荧光基团的二抗，请注意：
①避光保存！
②确定合适的二抗工作浓度，避免无信号或背景过高现象的发生。
③多蛋白检测时，选择偶联不同荧光基团的二抗，避免串色现象发生。
酶显色法（ICC）注意事项
1）生物素标记的二抗和链霉亲和素-HRP 能进一步扩增信号。也可以使用现代 HRP-聚合物二抗。
2）一些沉淀物具有光稳定性（HRP/DAB 具有很好的光稳定性，但 HRP/AEC 在阳光下会褪色），所以载玻片有可能储存多年。
3）酶/显色剂沉淀物的沉积区域比来自荧光源的光子沉积区域更宽，这可能影响个人解读结果的能力。同时，由于酶的扩增作用，定量一般比较困难。
▲二抗孵育经典荧光染料和常用颜色搭配推荐
Step3
封片、观察
复染、封片、观察
◆ 复染：在样本上滴加DAPI工作液，避光，室温，孵育10min；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5min；
◆ 封片及荧光观察：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。
该操作注意事项
1）苏木精使用建议：
在酶检测体系中，最常见的核复染剂是苏木精。苏木精是一种从木材中提取的蓝紫色显色剂，可以对核酸染色，不能对蛋白质染色。苏木精的蓝色与DAB（棕色/黑色）、AEC（粉色/红色）和固红（粉色/红色）等常用的显色剂可以形成很好的对比。但不适用于荧光检测。
2）DAPI使用建议：
▲DAPI建议现用现配，且不用染色时间过长。如果你的试剂是新配制的，避光复染2-3分钟就足够了。用PBS清洗玻片的时候，也建议在避光环境下清洗。因为DAPI本身发蓝光，如果蓝光太强，荧光显微镜会将蓝光显示成绿光，影响结果分析。
3）封片注意事项：
①滴加封片剂的时候，要将有细胞的一面朝下放置。可以选择抗荧光淬灭的封片剂也可以选择甘油封片。日常实验中，如果你不需要等很长时间才可以观察结果，或者不需要后续重复观察，也可以不用封片，立即镜检。
②滴加封片剂的时候只需要在载玻片的中心位置滴加一滴就好，差不多5μl左右的量就可以了。然后把有细胞的面朝下贴在载玻片上，注意不要产生气泡。
③如果封片剂滴加过多，那你的细胞荧光就会被完全覆盖住，什么都看不到了。
20个实验常见问题分析
1
二抗怎么选？
二抗的选择是重中之重，具体如何选择可参考下方表格；
▲二抗选择常见问题汇总
2
荧光信号有问题怎么办？
从样本本身、固定透化，到抗体孵育、拍照，每一步都有可能是原因。
3
高背景怎么办？
通过设置对照，可以迅速判断背景的来源。
▲对照包括：自发荧光对照（无一抗、二抗）、无一抗对照
实际应用
免疫荧光技术在生物医学研究和临床诊断中应用广泛。
生物医学研究：免疫荧光技术可用于研究细胞和分子结构、功能和相互作用，有助于揭示生物学机制。
药物研发：免疫荧光也可用于药物研发过程中，评估药物对特定分子或细胞的影响，指导新药设计和开发。
疾病诊断：免疫荧光可用于检测和诊断各种疾病，如自身免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等。
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