【疑难样本处理】小鼠脑神经胶质细胞与卵巢单细胞悬液的样本制备与分离
常规实验样本通常按照官方说明操作即可，而对于一些疑难样本则需要进行特殊处理，尤其是在样本制备上。
本篇内容就结合Bio-protocol期刊的2篇文献，为大家讲解：1）从新生小鼠脑中分离和富集主要原代神经胶质细胞，2）小鼠卵巢单个细胞的分离及其功能分析。
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实验解析/ 01
从新生小鼠脑中分离和富集主要原代神经胶质细胞
2024年1月20日，印度加尔各答科学教育与研究所的Jayasri Das Sarma团队在Bio-protocol期刊在线发表了一篇题为“从新生小鼠脑中分离和富集主要原代神经胶质细胞”的方法研究文章。
▲https://doi.org/10.21769/BioProtoc.4921
中枢神经系统（CNS）依赖于神经胶质细胞的复杂相互作用来执行重要的生理功能。为了全面了解这些神经胶质细胞之间的结构和功能相互作用，必须建立一个适当的体外系统，以便进行深入研究。
传统的从产前小鼠或神经干细胞建立原代神经元和混合胶质细胞培养的方法需要牺牲怀孕小鼠，并且具有仅产生特定类型细胞的缺点。本研究目前的方法克服了这些缺点，它利用出生后0天幼鼠的大脑来分离中枢神经系统驻留的神经胶质细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞[少突胶质细胞前体细胞（OPCs）和分化的少突胶质细胞]以及脑膜成纤维细胞，以及海马神经元，避免了牺牲怀孕小鼠，使这一过程高效且经济。
此外，通过这种方法，旨在提供逐步的说明，用于分离和建立不同的原代神经胶质细胞，并使用细胞特异性标记物对其进行表征。这项研究提供了一个机会，可以单独分离、培养和建立所有主要的中枢神经系统驻留细胞。这些细胞可用于各种基于细胞和生化测定的实验，以简化方式全面研究脑驻留细胞的细胞特定作用和行为。
亮点总结
1
利用单个幼鼠就能获得多种细胞，减少了动物使用数量，提高了实验的效率和成本效益。
2
本实验方法能够从单个幼鼠大脑中分离多种主要的神经胶质细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、脑膜成纤维细胞和海马神经元。
3
相比使用转化的细胞系，原代细胞更能真实反映细胞的自然状态，减少了由于细胞转化和突变积累带来的偏差。
实验设计
从出生第0天的乳鼠的脑(和脑膜)中分离脑膜成纤维细胞、神经元和各种胶质细胞，如星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。这个方案依赖于从任何小鼠甚至大鼠的大脑中精确地分离脑膜(富含成纤维细胞)和海马体(富含锥体神经元)。
该方案需要> 6-8 只乳鼠来收获足够的中枢神经系统驻留细胞。
组织收集
A）从第 0 天小鼠幼崽身上解剖的脑组织的流程图。脑膜完整。
B）将脑膜与大脑分离并单独保存用于成纤维细胞培养。收集脑膜后，取出无脑膜的大脑进行神经胶质细胞和神经元分离。
C）对脑膜进行机械切碎，然后以200×g离心10分钟。用 HBSS 重悬后，收集的细胞沉淀通过70 µm细胞滤网过滤，并再次以200×g离心10分钟。收集最终的重悬沉淀进行细胞计数，然后根据个别实验要求进行铺板。
脑膜切除
1
小心地从大脑中取出脑膜，同时使用超细镊子在解剖显微镜下观察。脑膜可以与脑组织区分开来，因为血管看起来呈红色，而大脑则呈乳白色。这是至关重要的一步，因为脑膜去除不充分可能会导致星形胶质细胞培养物中成纤维细胞的交叉污染（因为两种细胞的生长培养基相同）。
2
将脑膜收集在含有13 mL HBSS的15 mL离心管中。收集的脑膜可立即用于成纤维细胞分离，也可在冰上保存几分钟（约 30-45 分钟）。
脑膜成纤维细胞的分离
1
使用5 mL血清移液器将收集的脑膜均质化，70 μm细胞过滤器过滤（使用注射器柱塞让细胞通过）。
2
将滤液收集于15 mL离心管中，用HBSS冲洗滤器，并在200×g下离心10分钟。沉淀物是脑膜细胞。
3
再次添加HBSS洗涤细胞，重新悬浮沉淀，通过70 µm过滤器过滤，并再次200×g离心10分钟（重复此步骤两次）。
4
洗涤完成后，将沉淀重新悬浮在星形胶质细胞特异性培养基中。
5
将细胞铺板并使其生长72小时。
6
72小时后，在显微镜下观察贴壁细胞。
7
用1× HBSS（也可以使用1× PBS）轻轻清洗，去除未贴壁的细胞和碎片，并添加新鲜培养基。
8
每2-3天更换一次培养基，直至汇合。
海马体的分离
1
在显微镜下观察无脑膜的大脑并去除嗅球和小脑。将这些组织保存在含有Hanks的50 mL 离心管中，最后分离大脑半球。
2
将大脑半球切成两半，并将海马体从皮质内侧表面切开。置于冰上含有13 mL HBSS+的15 mL离心管中。
3
分离海马体后，将剩余的脑组织质量收集在您之前收集小脑和嗅球组织的同一个50 mL离心管中。
4
这些剩余的组织将用于神经胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）的分离。
神经元分离
1
取含有HBSS+的15 mL离心管以及先前收集的海马组织，并在4°C下以100×g 离心5分钟。
2
弃去上清液，并向管中添加1 mL胰蛋白酶和300 µL DNase I。充分混合并在室温下孵育15分钟。
3
添加3 mL DMEM+以停止反应（中和酶）。
4
4°C 400×g 离心5分钟。
5
弃去上清液，加入DMEM+；轻轻地上下吹打，直至形成细胞悬浮液。
6
然后，将细胞悬浮液通过50 mL离心管上的70 µm细胞滤网，并用等体积的培养基（例如 5 mL悬浮液/5 mL培养基）冲洗滤网。
7
使用细胞计数器计数细胞数，用DMEM+将其稀释至106个细胞/mL。
8
接种于PDL包被的培养板中。
9
在37 °C和5% CO2下孵育。
10
24小时后，将培养基更换为神经元特异性培养基并观察神经元的轴突生长。
11
每2-3天更换一次培养基。大约5天后，神经元就可以进行实验了。
脑驻留神经胶质细胞（星形胶质细胞、
少突胶质细胞、小胶质细胞）的分离
1
50 mL离心管中加入Hanks准备液（5 mL用于多个大脑），连同剩余脑组织块（分离脑膜和海马后）。将脑膜与脑实质分离，并将它们分开，以避免星形胶质细胞培养物中成纤维细胞的交叉污染。
2
使用5 mL血清移液器上下移液10次以打碎组织（组织切碎）。
3
每个大脑添加0.25 mL胰蛋白酶和0.25 mL DNase I。
4
37°C 振荡水浴孵育 30 分钟（参见酶消化步骤）。
5
消化后，每个大脑添加 0.25 mL FBS 和 5 mL Hanks 作为制备溶液。
6
使用移液管充分混合并以600×g离心10分钟。
7
用温和的真空吸去上清液。注意：弃上清时请勿搅动沉淀，否则会影响细胞量。
8
添加5–10 mL的Hanks制备溶液，并再次以600×g离心10分钟。
9
吸去上清液。
10
添加5–10 mL的Hanks作为制备溶液，重新悬浮沉淀，并通过70 µm细胞过滤器。再次以 600×g离心10分钟（再重复该步骤一次）。
11
将沉淀重悬于制备溶液的血清中。
12
在细胞计数器中对细胞进行计数，并将细胞置于未包被的组织培养瓶中。
13
将接种的细胞在制备溶液血清中在5% CO2培养箱中于37 °C下孵育24小时。
⚫ 细胞特异性培养基变化
14
24小时后，用含Ca2+和Mg2+的HBSS洗涤细胞，并将星形胶质细胞特异性培养基放入要生长星形胶质细胞的培养瓶中，将少突胶质细胞特异性培养液放入培养OPC的烧瓶中（转至第21步，用于OPCs）。
⚫ 星形胶质细胞的富集以及从混合胶质细胞中分离小胶质细胞
15
一旦混合的胶质细胞形成融合的单层，停止添加新鲜的培养液10天(饥饿)，以允许星形胶质细胞和小胶质细胞的不同黏附。饥饿会导致显著的小胶质细胞生长。在这些培养物中，它在12-14天达到顶峰。
16
饥饿完成后，在培养瓶中以180 rpm的转速在37℃下振摇45分钟，以从紧密粘连的星形胶质细胞中去除粘连较少的小胶质细胞。
17
快速去除含有非粘附性细胞的培养液，并将其收集到15 mL管中(转至步骤20)。
⚫ 小胶质细胞分离
18
将悬浮在培养基中的细胞放入15 mL管中，并在4℃下以300×g离心5分钟。
19
重悬离心沉淀，用新鲜的星形胶质细胞特异性培养基稀释，使细胞终浓度为8×105细胞/mL；向4孔室玻片的每个孔中添加0.5 mL，或向6孔板的每个孔添加2 mL。
⚫ 星形胶质细胞富集
20
小胶质细胞摇动后，用无菌PBS清洗后将培养瓶保持在星形胶质细胞特异性培养基中。对于星形胶质细胞分离，用胰蛋白酶消化剩余的星形胶质细胞贴壁单层，并将其用作富集星形胶质细胞培养物以进行进一步实验。
⚫ OPCs分离
21
24小时后（步骤13），用含Ca2+和Mg2+的HBSS洗涤去除非贴壁细胞。
22
去除制备培养基血清24小时后，向细胞中添加少突胶质细胞特异性培养基。
23
将这些混合神经胶质培养物维持在少突胶质细胞特异性培养基中直至汇合（大约一周）。
24
OPC主要生长在混合神经胶质细胞培养物（主要是星形胶质细胞层）的顶部，并且比星形胶质细胞的粘附性相对较差，应通过冲洗方法去除。
25
将脱落的少突胶质细胞接种到PDL包被的盖玻片上，并维持在少突胶质细胞特异性培养基中，直到培养物达到80%汇合。
⚫ OPCs分化
26
OPC完全汇合后移除培基；然后，用含Ca2+和Mg2+的1× HBSS清洗OPC，并添加少突胶质细胞分化培养基培养7-10 天。
27
第7天之后，这些可以用于实验。
文章验证
这个方法的可重复性已经被本文作者印度加尔各答科学教育与研究所（Indian Institute of Science Education and Research Kolkata）Jayasri Das Sarma团队验证过，相关实验数据与结果发表在Viruses, DOI:10.3390/v15010215。
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参考文献
Kumar Samal, S., Sharma, M. and Das Sarma, J. (2024). Isolation and Enrichment of Major Primary Neuroglial Cells from Neonatal Mouse Brain. Bio-protocol 14(2): e4921. DOI: 10.21769/BioProtoc.4921.
Safiriyu AA, Mulchandani V, Anakkacheri MN, Pal D, Das Sarma J. Proline-Proline Dyad in the Fusion Peptide of the Murine β-Coronavirus Spike Protein's S2 Domain Modulates Its Neuroglial Tropism. Viruses. 2023 Jan 12;15(1):215. doi: 10.3390/v15010215. PMID: 36680255; PMCID: PMC9865228.
实验解析/ 02
小鼠卵巢单个细胞的分离及其功能分析
近期，STAR Protocols 期刊在线发表了“Isolation of single cells from individual mouse ovaries for flow cytometry and functional analysis”的方法文章。
▲https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102710
研究人员提出了一种经过验证的工作流程，可以从一只小鼠身上分离出足够多的可存活的单个卵巢细胞，而不需要从几只小鼠身上汇集。作者提供了发情阶段、卵巢收获和分离、卵巢细胞染色、数据收集和分析所必需的步骤。该方法允许使用这些单细胞悬液进行流式分选、流式细胞术分析或功能体外分析，旨在最大限度地分离免疫细胞，包括T细胞亚群。
实验设计
发情阶段判定>>
1
实验当天收集阴道灌洗液(VL)进行周期分期测定。
【替代方案】在处死小鼠前24小时内，通过腹腔注射0.2 mg/kg的diethylstilbesterol，或小鼠处死前24-48小时内通过皮下注射10 mg/kg的medroxyprogesterone 17-acetate，以分别将所有小鼠的生理周期调整为动情期或动情间期。
2
用移液管吸取200 μL无菌PBS，冲洗小鼠阴道3次，将灌洗液置于标记的小瓶中。
3
制片，亚甲蓝染色。
4
镜下观察，测到发情周期阶段。
结果判读
通过有核上皮细胞(中间点缀有角化上皮细胞和白细胞)的显性存在来确定动情前期的阶段，通过无核角质上皮细胞的显性存在来确定动情期，通过白细胞、有核上皮细胞和角化上皮细胞相当均匀的混合组合来识别动情后期，通过白细胞的显性存在来确定动情间期。
小鼠卵巢和脾收集及其单细胞悬液制备
A）解剖并暴露腹腔。
B）脾脏位于腹膜腔的肋骨下方，背侧位置的左侧。
C）移出肠道（或胃肠道）和腹部脂肪，找到位于输卵管和子宫顶部的卵巢。
D）近距离观察孤立的生殖道和卵巢。
E）分离的小鼠卵巢。
F）脾脏研磨、裂红处理，制备单细胞悬液。
G）卵巢单细胞悬液制备
消化液：RPMI (4.5 mL)和0.1%胶原酶IV (0.5 mL，0.01 mg/mL)。
gentleMACS octo dissociator程序：20m:00s; Temp: on 37℃; rpr 400。
panel>>
结果判读>>
1
FSC-A SSC-A排除非细胞碎片和未裂解的红细胞。
2
使用FSC-A FSC-H去黏连。
3
选择Zombie Aqua阴性活细胞进行后续分析。
4
将T细胞识别为CD45+CD3+细胞，并进一步分类为CD8+和CD4+ T细胞，并将NKT细胞识别为CD3+ CD4-、CD8-和NK1.1+。
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