肿瘤免疫前沿热点：三级淋巴结构（TLSs）研究新视角

三级淋巴结构（ertiary Lymphoid Structures, TLSs）主要由B细胞、T细胞、树突状细胞（DCs）、高内皮小静脉（HEVs）、滤泡网状细胞（FRC）和滤泡树突状细胞（FDC）组成，亦称第三淋巴样器官或异位淋巴样结构。TLSs指的是在生理条件之外，于非淋巴组织中后天形成的、具有明确组织结构的免疫细胞集合体。这些结构常见于由自身免疫性疾病、慢性感染及癌症引发的慢性炎症环境中。

在肿瘤微环境中，TLS扮演着促进免疫细胞向实体瘤内部浸润的关键角色，因此，TLS的形成与未接受治疗的患者的生存率之间存在显著的正面关联。类似地，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者群体中，TLS的发展也常被视作治疗反应改善的一个积极标志。

TLS（三级淋巴结构）最初形成于血管周围区域，这些区域富含细胞外基质、微小血管、淋巴管及神经元，且在生物体内各器官中相对保守，为组织内常驻免疫细胞提供了独特的生态位。起初，TLS以小型的T细胞和B细胞聚集体形式出现，随后逐渐扩展并发育成熟，形成包含不同B细胞和T细胞分区的复杂结构。

在TLS的未成熟阶段，抗原呈递过程与紧密的T细胞-B细胞相互作用共同驱动淋巴细胞的激活及TLS的进一步成熟。伴随这一过程，原本常驻的成纤维细胞发生转分化，转变为多种表型以协同TLS的整体发育。

TLS的结构特征显著，其核心区域由CD20⁺ B细胞构成，这些B细胞被CD3⁺ T细胞紧密环绕，形成类似于次级淋巴器官（SLO）中的淋巴滤泡结构。尽管不同TLS的具体细胞组成可能有所变化，但T细胞区域内，CD4⁺ T滤泡辅助（TFH）细胞通常占据主导地位，同时也可观察到CD8⁺ 细胞毒性T细胞、CD4⁺ T辅助1（Th1）细胞及调节性T细胞（Tregs）的存在。

除了B细胞和T细胞群体构成了TLS免疫细胞的主要部分外，TLS还包含多样化的树突状细胞（DC）亚群，如源自间充质的CD21+ 滤泡树突状细胞（FDC），它们主要定位于滤泡区域，对TLS的功能至关重要。此外，滤泡内还散布着CD68+ 巨噬细胞，负责清除凋亡细胞，这一功能与它们在SLO中的作用相似。

TLS还具备一个致密的基质网络，该网络类似于SLO中滤泡网状细胞（FRC）所构建的网络，它不仅稳固了TLS的结构，还将其锚定在慢性炎症状态下的组织部位。最后，TLS拥有外周淋巴结寻址素（PNAd）阳性的高内皮小静脉（HEV），这些特殊血管为TLS提供了独特的循环系统，被认为在淋巴细胞的招募过程中发挥关键作用。

在局部环境中，淋巴细胞或基质细胞负责生成CXCL13和IL-7这两种关键因子，它们作为信号分子，招募淋巴细胞诱导因子（如LTi细胞）到炎症部位。值得注意的是，在多种病理条件下，TH17细胞、B细胞或M1型巨噬细胞能够展现出替代LTi细胞的功能，启动TLS的形成。

LTi细胞与局部基质细胞之间存在着密切的相互作用模式，这种互动类似于次级淋巴器官（SLO）中淋巴组织组织细胞的行为。特别地，LTi细胞通过LTα1β2与基质细胞表面的LTβR结合，激活一系列信号通路。这一信号传导过程促使基质细胞分泌VEGFC，进而促进高内皮静脉（HEV）的发育，并诱导表达多种粘附分子，包括VCAM1、ICAM1及MADCAM1，这些分子对于淋巴细胞的粘附和迁移至关重要。此外，LTβ-LTβR信号传导与LTi细胞分泌的IL-17协同作用，触发了一系列趋化因子的产生，主要包括CXCL12、CXCL13、CCL19和CCL21。这些趋化因子在局部形成一个强大的化学梯度，不仅诱导淋巴细胞表达LTα1β2，还从邻近的HEV中吸引淋巴细胞，并精确调控它们进入T细胞和B细胞区域的过程。部分CD4⁺ TH被极化为TFH。I型干扰素和IL-1等细胞因子也被证实能够刺激CXCL13的生成。

研究表明，TLS（三级淋巴结构）对免疫检查点阻断（ICB）治疗的反应具有预测价值。在黑色素瘤、肾细胞癌等癌症的治疗前活检中，TLS的存在及活跃的B细胞浸润与患者对PD-1单独或联合PD-1与CTLA-4阻断的积极反应相关联。此外，在黑色素瘤ICB应答者的治疗前活检中，富含TLS成分，特别是记忆样B细胞和浆母细胞样细胞。进一步分析显示，ICB治疗不仅能促进TLS的形成，还在高危黑色素瘤和尿路上皮癌的新辅助ICB治疗后，响应患者的肿瘤中TLS相关B细胞数量显著增加，相比治疗前样本。

然而，TLS在特定条件下也可能被肿瘤细胞利用，促进淋巴浸润和肿瘤的淋巴转移。例如，在肝细胞癌（HCC）中，祖细胞在肝肿瘤形成前即出现在TLS中，提示TLS可能作为恶性细胞转化和生长的微环境。同样，在人类乳腺癌的TLS中也发现了癌细胞簇，这些细胞簇与淋巴浸润和更高的淋巴结分期密切相关。尽管上述观察揭示了TLS组成的异质性及其预后价值，但直接证明存在促进肿瘤进展的“抑制性”TLS的证据仍然较为有限。

当前的研究热点是如何从组织中准确识别、检测并量化TLS。当前TLS的评估及鉴别方式主要包括HE 染色鉴别TLS 分布、免疫组织化学或荧光对TLS的免疫细胞定性和定量以及基因表达谱检测TLS相关趋化因子。

HE染色是一种常用的组织染色技术，根据细胞核、细胞质以及组织结构呈现的不同染色强度、颜色色调以及纹理，鉴别肿瘤组织中的各种细胞形态和结构，包括TLS。经多聚甲醛固定并石蜡包埋肿瘤组织后，在HE 染色的组织中，可以观察到密集的淋巴细胞聚集区域，其中包括B 细胞、T 细胞。

成熟的TLS 具有类似次级淋巴器官（Secondary Lymphoid Organs，SLO） 的结构，含有FDC 和GCs，并且B 细胞位于GCs，可观察到聚集此区域的淋巴母细胞，同时T 细胞则分布在滤泡的外围区域。通过观察这些特征，研究者可以在显微镜下识别TLS的存在。

▲DOI：10.1053/j.gastro.2023.10.022

通过抗体特异性标记，免疫组织化学对TLS中各类免疫细胞的目标蛋白进行选择性地标记，进而可以在显微镜下观察到特定细胞类型的分布和密度。因此，IHC和mIHC技术是研究肿瘤微环境中TLS分布的一种强有力技术，能够揭示TLS内部的免疫细胞组成成分和空间分布位置。对于TLS的研究，通常关注的免疫细胞包括T 细胞、B 细胞和树突状细胞等。

例如，通过CD20 抗体进行标记，有助于揭示TLS 中B 细胞的分布，同时标记CD21 或CD23 可以显示滤泡结构，以判断具有GCs 的成熟TLS。使用CD4 或CD8 抗体标记TLS 中的T 细胞，加以转录因子标记有助于评估各类T 细胞亚群的浸润，如辅助Th1（转录因子T-bet）、调节性T 细胞（转录因子FOXP3）和滤泡辅助T 细胞（转录因子BCL6）。

▲DOI：10.1038/s41467-024-46873-w.

基因表达谱检测是分析细胞或组织中成千上万个基因表达情况的技术。基因表达谱分析可以量化与肿瘤微环境TLS形成和功能相关的趋化因子和其他免疫调节因子的表达。

趋化因子基因特征主要涉及CCL5、 CCL19、 CXCL10 和CXCL13 等，这些基因与炎症相关，并可预测结肠直肠癌、黑色素瘤和乳腺癌等恶性肿瘤患者的良好预后。

▲DOI：10.1126/scitranslmed.adh0380

▲DOI：10.1016/j.immuni.2022.02.001

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Sautès-Fridman C, Petitprez F, Calderaro J, Fridman WH. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2019;19(6):307-325. doi:10.1038/s41568-019-0144-6。

Schumacher TN, Thommen DS. Tertiary lymphoid structures in cancer. Science.2022;375(6576):eabf9419. doi:10.1126/science.abf9419