搞不定GST pull-down？看这篇！实验全流程/结果图解读/常见问题解析……

GST pull-down是体外验证两种蛋白直接相互作用的研究方法，其原理是将目的蛋白与GST融合表达，固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上作为与目的蛋白亲和的载体，充当“诱饵蛋白”，捕获相互作用的“捕获蛋白”（靶蛋白），将结合物洗脱后WB分析确认两种蛋白的相互作用。

本文将从GST pull-down实验流程、影响实验结果的因素、实验结果图解读、常见问题分析&解决、实际应用场景等，帮助大家更好的掌握GST pull-down技术。如果你也认同本篇内容，就点赞鼓励一下小福吧！

与它类似的Co-IP实验我们也写过：祖传Co-IP（免疫共沉淀）实验操作全流程，附结果图解读+疑难问题解析

GST pull-down实验原理

1）基本概念

利用重组技术将探针蛋白与GST谷胱苷肽巯基转移酶融合，融合蛋白通过GST与固相化在球珠上的GSH谷胱甘肽结合，从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白。GST pull-down 研究对象是蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

2）结合原理

GST pull-down利用DNA重组技术将探针蛋白与GST谷胱苷肽巯基转移酶融合。融合蛋白通过谷胱苷肽巯基转移酶与载体上的谷胱苷肽分子特异性亲和原理，从而实现融合的探针蛋白与谷胱苷肽包被的琼脂糖球珠特异性结合。

3）分离原理

GST pull-down中所用到的琼脂糖球珠载体由于其复合体比重大（而非体系蛋白比重小），能够借助离心力更快速的沉淀分离。在经过漂洗、离心之后就可以达到分离探针蛋白的目的。

4）GST pull-down实验优缺点

GST pull-down优点：

可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作反应，区别于Co-IP的复杂细胞背景，是体外验证蛋白质分子互作的经典方法；

GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高，能够分离出纯度更高的蛋白体系。

GST pull-down缺点：

验证蛋白质互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态；

融合表达的GST标签肽链较长，可能会改变原目的蛋白原有的折叠结构。

5）GST pull-down、Co-IP的区别

GST pull-down：

原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果，只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明。

Co-IP：

细胞内高表达目的蛋白，并通过IgG球珠-抗体-蛋白复合物体系，分离出互作的蛋白复合物，是细胞内的体内反应结合。

GST pull-down实验流程

蛋白的抽提与纯化；

真核表达蛋白抽提；

体系孵育与pull-down；

GST pull-down 验证与结果分析；

1）蛋白的抽提与纯化

原核表达蛋白分离纯化：

在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60min；

4℃，4000rpm离心5min，弃去上清；

加入200ul预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，洗涤一次，4℃，4000rpm离心5min，弃去上清，重复此步骤3次；

吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-A的琼脂糖凝胶。

2）真核表达蛋白抽提

3）体系孵育与pull-down

混合含有A-GST蛋白和含有其他蛋白的溶液，将混合物在4°C旋转混匀孵育过夜；

4℃，4000rpm离心5min，弃去上清液后，用预冷缓冲液进行洗涤，重复三次；

吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入20ul 1×蛋白电泳上样缓冲液，将蛋白样本煮好后，分装冻存于-80℃冰箱，用于后续检测。

4）GST pull-down 验证与结果分析

GST pull-down实验经过考马斯亮蓝和Western blot检测后即可进行结果分析。

考马斯亮蓝检测：通过考染胶中纯化条带区别于未纯化样品条带的分布情况，可以明显看出纯化后的探针蛋白A，在实验组与对照组中都有分布；下面与蛋白A互作的未知蛋白在实验组中存在，在对照组中不存在，证明实验体系与结果准确有效。

Western blot检测：探针蛋白A明显存在于Input组和实验组中，并且阴性组中没有，证明实验体系洗脱充分有效；下面出现的互作的未知蛋白在Input组和实验组中有明显条带，且在阴性组中没有条带，证明实验结果准确可靠。

影响GST pull-down实验结果的因素

载体选择：

对于不同的实验需要构建的载体是不同的，载体的选择对融合蛋白有很大的影响，需要综合考虑表达融合蛋白的可溶性、能否被 IPTG 诱导表达、以及是否能够高质量表达。目前，经改造的pGEX 载体由于同时具备以上优点而广泛应用于构建 GST 融合蛋白。

诱导温度：

不同温度下融合蛋白存在的形式不一，诱导温度的选择对于蛋白的表达也具有较大影响。例如，温度敏感型表达载体需要高温诱导（42ºC），而大部分载体需要低温诱导，因为蛋白间存在较强的温度依赖性疏水作用，温度高时蛋白易聚集形成沉淀，会增加蛋白形成包涵体的几率。从目前研究报道来看，获取可溶性蛋白的最佳诱导温度一般集中在 20～30℃ 。

诱导时间：

加入诱导物的时机，一般选择在细菌生长的对数期，此时细菌生长速度快，生命活力比较旺盛，此时加入诱导物能获得较多的可溶性融合蛋白。加入诱导物后的诱导时间是根据诱导温度来确定的，一般诱导温度高，诱导表达的时间就较短；温度低，诱导表达的时间就需要适当延长。

诱导物浓度：

目前广泛应用的诱导 pGEX 系列载体表达的诱导物多为IPTG，该诱导物不会被细菌代谢而保持稳定的浓度，但由于具有一定的细胞毒性，在使用时需要格外注意浓度问题。已有的报道其使用的终浓度从0. 005 mmol/L 到 5 mmol/L不等，但IPTG终浓度过高时，会在短时间内诱导出大量的融合蛋白，导致不正确的折叠以及形成包涵体，不利于获得可溶性蛋白。因此在实验中通常采用低浓度、长时间诱导表达的方式，以获取足够量的可溶性融合蛋白。

GST 标签的影响：

虽然大多数情况下不会造成影响，但GST标签仍可能会影响蛋白的正确折叠。如果对融合蛋白进行质量控制，会使实验结果更加可信。例如加入核磁共振、X射线晶体分析等方法验证蛋白结构有无变化；通过结合已知互作蛋白验证蛋白功能有无变化等。

DNA和RNA的影响：

例如，两种并不互作的DNA结合蛋白可能会因为DNA的存在而出现相互作用的假阳性结果，因此，在进行GST pull-down实验时，加入核酸酶的步骤十分必要。

GST pull-down实验结果图怎么看

在清楚知道操作流程的前提下，弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤，结合图中展示的结果进行分析，便可以看懂实验结果图。

文献案例1

结果解读

作者在GST的N端融合Sw-5b蛋白，在NSm21蛋白添加YFP标签便于免疫印迹。

GST pull-down+YFP IB组：表示GST pull-down实验后用YFP进行免疫印迹。发现GST + NSm21-YFP组和GST-Sw-5b + YFP组无条带，表明GST pull-down体系中的GST与NSm21-YFP，GST-Sw-5b与YFP组分之间无互作，是阴性对照组。GST-Sw-5b + NSm21-YFP组有条带，表明两种物质之间存在互作，结合阴性对照组结果证明是Sw-5b 与NSm21之间存在互作。

GST pull-down+GST IB组：表示GST pull-down实验后用GST进行免疫印迹。发现三组均有条带，表明GST pull-down实验体系可以正常发挥功能，也表明各组体系中含有GST相关的组分。

Input + YFP IB组：表示不经过GST pull-down实验，直接对实验前各组的混合体系用YFP进行免疫印迹，是阳性对照组表明各组有YFP相关组分。

文献案例2（Co-IP&GST pull-down结果分析）

Input：全细胞裂解液，诱饵蛋白与靶蛋白表达的检测确认。含有细胞内所有的蛋白，可认为是阳性对照。也就是处理完样本得到的细胞裂解液，在做IP实验之前，需要先跑WB，确认样本中含有蛋白A和蛋白B。

IP：全称immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。

IB：全称immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。

IgG：阴性对照。Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同来源同种型，如Anti-A是兔来源IgG型，则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体。

结果解读

由Input组的条带可以得到结论，蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题；

阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验，结果蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；

而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验，成功把蛋白A沉淀下来了，与此同时蛋白B也被沉淀下来，进而得到结论：蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。

该研究将Myc-NICD表达载体导入293T细胞，然后进行Co-IP分析，以确定Myc-NICD与内源性AIB1之间的相互作用。

A上图中，Myc-NICD是诱饵蛋白，靶蛋白是AIB1。抗体是针对AIB1的IgG。

①用Myc-NICD蛋白的IP级抗体拉蛋白Myc-NICD，因为存在互作，还有其它蛋白会被拉下来。在WB检测时，Input蛋白和下拉蛋白中都能用Myc-NICD的抗体检测到Myc-NICD；

②验证Myc-NICD和AIB1是否有相互作用。首先在Input蛋白中可以用AIB1的抗体检测到AIB1；其次，在Myc-NICD抗体下拉的蛋白物中也可以用AIB1的抗体检测到AIB1。结果满足上述两个条件，则说明Myc-NICD和AIB1之间存在相互作用。

③结果表明，AIB1抗体能沉淀内源性AIB1和Myc-NICD，而不是对照抗体(图A，上图)。同理，AIB1和Myc-NICD可以被Myc抗体下调(图A，下图)。这些结果表明，AIB1可以与NICD在细胞内相互作用。此外，通过使用抗AIB1和抗NICD抗体的Co-IP分析，也可以在CT26细胞中检测到内源性AIB1和NICD的相互作用(图B)。

为了确定AIB1是否可以直接与NICD结合，将大肠杆菌产生的GST-NICD蛋白与基于大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成系统产生的AIB1蛋白孵育，进行GST pull- down检测是否直接互作。

结果表明，GST-NICD蛋白，而不是GST，能够下调AIB1(图C)，表明AIB1可以直接与NICD结合。为了确定AIB1的哪些结构域可以与NICD结合，在293T细胞中表达了不同的AIB1结构域蛋白，并进行了GST pull-down实验。结果表明，AIB1的HAT结构域负责AIB1与NICD的相互作用(图D，下图)。

为了确定AIB1是否能与MAML1相互作用，将Flag-MAML1表达载体导入293T细胞，并进行了Co-IP实验。结果表明，AIB1抗体可沉淀内源性AIB1和FlagMAML1(图E，上图)。反过来，AIB1和Flag-MAML1可以被Flag抗体拉低(图E，下图)。这些结果表明，AIB1在细胞内可以与MAML1相互作用。

为了确定 AIB1 是否可以直接与 MAML1 结合，将大肠杆菌产生的 GST-MAML1 蛋白与基于大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成系统产生的 AIB1 蛋白一起孵育，进行 GST pull-down下拉试验。结果表明，GST-MAML1 蛋白能够下拉 AIB1，但 GST 不能（图 F），这表明 AIB1 可以直接与 MAML1 结合。