细胞死亡新热点：“免疫原性细胞死亡（ICD）”研究思路汇总
免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）的概念于2005年首次发现，用于描述可以引起免疫应答的细胞死亡。
▲细胞死亡方式多样，细胞死亡命名委员会（NCCD）在2018年就明确定义了十二种调节性细胞死亡（Regulated cell death，RCD）。
近年来，“铁死亡”、“铜死亡”、“细胞焦亡”、“坏死性凋亡”频频登上热门，如何在细胞死亡领域突破传统思路，创新性拿下国自然呢？不妨关注一下免疫原性细胞死亡！
本篇文章我们一起来详解：ICD概念解析&特征、在癌症治疗的应用、诱导ICD、测量ICD生物标志物的方法、肿瘤环境中评估ICD的体内方法、ICD相关思路与课题。
ICD相关资料&其他细胞死亡往期内容见文末。
免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death，ICD）是一种能在免疫功能完善的宿主体内激发适应性免疫响应的调控性细胞凋亡（Regulatory Cell Death，RCD）模式。
ICD是细胞死亡的一种特殊形式，它不仅能够导致细胞死亡，还能激发机体对死亡细胞释放的抗原的特异性免疫反应。这种死亡方式是由应激压力驱动的，涉及在免疫活性宿主中激活针对死亡细胞的免疫系统。
免疫原性细胞死亡的1个重要特征：
释放损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns，DAMPs）。
这些分子模式包括细胞表面暴露的钙网蛋白（Calreticulin，CRT）和热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs），以及细胞外释放的三磷酸腺苷（ATP）、高迁移率族框1（High-mobility group box 1，HMGB1）等。
这些DAMPs可以作为危险信号，被先天免疫系统的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs）所识别，如Toll样受体（Toll-like Receptors，TLRs）和NOD样受体（NOD-like Receptors，NLRs），从而激活抗肿瘤免疫反应。
长期以来，调节细胞死亡(RCD)是免疫沉默或甚至是耐受性事件，然而，现在已经清楚的是：至少在特定的情况下，应激诱导的RCD可以驱动炎症反应，最终可能激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)驱动适应性免疫，并建立长期免疫记忆。
现在ICD概念已经被广泛应用于肿瘤免疫。通常的各种治疗方法——包括特定的化疗药物、放疗和一些靶向的抗癌药物——都会导致正向激活的ICD，从而产生针对肿瘤的免疫反应，以支持治疗效果。
细胞死亡可以刺激免疫系统，但是只有同时兼具抗原性、佐剂性的情况下，再具备合适的微环境，这个死亡才能称得上免疫原性细胞死亡。
1）抗原性 (antigenicity)：
在缺乏特定抗原的情况下，即当这些抗原未被中枢或外周耐受机制所覆盖时，RCD仅能够触发炎症反应，而无法激活适应性免疫反应。这表明，特定的抗原存在是RCD触发适应性免疫的关键。
2）佐剂性 (adjuvanticity)
当存在具有抗原性的情况时，RCD要想启动适应性免疫反应，还必须伴随有足够的佐剂作用。这是因为佐剂能够增强抗原的免疫原性，使其更容易被免疫系统识别并引发免疫反应。相反，如果缺乏佐剂，即使抗原被递呈给T细胞，也可能导致免疫耐受性的产生，而不是激活免疫反应。
3）许可发生的微环境（permissive microenvironmental conditions）
微环境对于ICD引发的免疫反应具有重要影响。只有当ICD所激活的树突状细胞(DC)能够在适宜的微环境中正常工作时，它们才能够引导T细胞进入肿瘤病灶，介导效应功能并建立记忆反应。
不同的ICD诱导剂已被证明可引起与ICD生物标记物不完全重叠的分子特征。
这不仅加强了在筛查活动中同时评估多个替代ICD生物标志物的必要性，而且还确定了危险信号下游支持适应性免疫的分子和细胞机制中最初未被怀疑的多样性。
ATP：
在ICD过程中，ATP以自噬依赖的方式释放，通过ANNexin通道胞吐含ATP的囊泡。细胞外ATP，通过嘌呤能受体P2RY2，向DC前体细胞和巨噬细胞起释放“发现-我”信号，从而促进招募髓系细胞到活性ICD位点。细胞外ATP介导促炎作用，激活CASP1依赖的NLRP3炎症小体形成，随后分泌成熟IL-1β和IL-18。
HMGB1：
ICD细胞释放HMGB1（High-mobility group box 1）。胞外HMGB1结合多个由髓系细胞表达的PRRs（AGER，TLR4），激活信号通路，活化免疫。
Calreticulin（CALR）：
CALR暴露在肿瘤细胞浆膜表面，是一个“吃我”信号，促进其被DC细胞等吞噬。表面暴露的CALR结合APC细胞表面的LRP1（CD91），进而激活天然免疫和适应性免疫。CD91的聚集可以增强死亡细胞的吞噬。
Annexin A1（ANXA1）：
ICD释放ANXA1的机制还不是很清楚，但是ANXA1是DC细胞归巢的重要因子。
1型IFN：
RNA及DNA通过TLR3及STING，激发1型IFN的释放，进而结合免疫细胞表面的受体，激活免疫。
在ICD诱导下，死亡的肿瘤细胞释放肿瘤抗原和DAMPs。
DAMPs刺激DC上的模式识别受体(PRR)，导致T细胞活化，并根据五种信号启动肿瘤特异性抗肿瘤免疫反应。
信号1是细胞死亡过程本身，导致DAMPs，并为抗原交叉提供肿瘤抗原。DAMPs介导吞噬和处理死亡细胞的DC的吸引和激活(信号0)。DC提供3种信号来激活T细胞；信号1是通过T细胞受体(TCR)介导的抗原识别，由DC将主要组织相容性复合体(MHC)I或MHC II分子上的肿瘤抗原分别递呈给CD8+T细胞和CD4+T细胞而触发。
信号2是初始T细胞与DC上的共刺激受体(如CD80)的结合，CD80是有效激活T细胞所必需的。信号3是DC传递的额外的极化和分化信号，包括白介素12(IL-12)或I型干扰素(IFNs)，它们对T细胞分化为肿瘤特异性IFN-γ的T细胞至关重要。
研究发现某些蒽环类化合物和奥沙利铂等化疗药物不仅诱导肿瘤细胞凋亡，而且可以引起免疫原性细胞死亡（ICD），通过诱导肿瘤细胞自噬，释放3类信号：
1）钙网蛋白暴露在细胞表面，刺激树突状细胞（DC）吞噬；
2）三磷酸腺苷释放，招募DC进入肿瘤灶；
3）高迁徙率族蛋白B1促进DC与垂死肿瘤细胞形成稳定结合，诱导机体产生特异性的T细胞抗肿瘤免疫。
ICD作为肿瘤细胞的一种应激反应，可激活人体的先天和适应性免疫。大量的研究表明ICD可以逆转肿瘤免疫抑制微环境，提高免疫治疗的敏感性，有助于免疫治疗。
因此，将ICD诱导剂合理、安全地应用到肿瘤治疗中，对于激活机体抗肿瘤免疫，产生长远的抗肿瘤效果具有重要意义。
然而，一些恶性细胞已经进化出过多的策略来规避作为免疫原性的RCD的检测。
这些策略中的每一种都包括与缺陷的ATP或I型干扰素分泌有关的自噬反应的改变，细胞外ATP降解导致腺苷能信号的优势，CALR暴露或ANXA1分泌不足，CD47上调，抑制PRR信号，以及其他局部和全身免疫抑制策略，为开发支持恢复的癌症免疫监控的联合治疗方案提供了特定的靶点。
目前免疫原性细胞死亡已经成为标准肿瘤学词汇的一部分，促进了新治疗剂、治疗组合和个性化策略的开发。
1）化疗药物：
5-氟尿嘧啶（5-FU）：通过抑制胸苷酸合酶，展现出抗结直肠癌的良好疗效；
奥沙利铂：触发内质网应激和CRT暴露，有效引发免疫原性细胞死亡（ICD）；
伊立替康：与5-FU联合使用时，调整细胞增殖并表达MHC-1，具有ICD特征；
金丝桃素联合光动力疗法：诱导phox-ER应激，促进ecto-CRT表达和ATP、HSPs的释放，有效抑制肿瘤增长。
2）纳米药物：
多柔比星纳米盘：相较于游离多柔比星，显著提高肿瘤中药物浓度和CD8+淋巴细胞数量，对MC38结肠细胞疾病疗效显著。
聚合物纳米载体封装姜黄素（PNCC）：显著增强对结直肠癌的化学预防效果，减少肿瘤体积和数量，并抑制β-连环蛋白激活，刺激Bcl-2相关X蛋白生成。
3）氧增强光动力疗法：
通过调控光敏剂和活性氧，引发phox-ER应激反应，诱发抗癌免疫以抵抗癌细胞；
克服实体瘤缺氧环境对光动力疗法（PDT）疗效的限制，利用蛋白杂交技术装载氧纳米载体，提高肿瘤组织氧浓度，优化PDT的抗肿瘤效果。
ICD的主要特征可以通过流式细胞术、（免疫）荧光显微镜、免疫印迹或发光测定法基于各种不同的方法进行评估。
1）评估ICD诱导剂驱动的细胞毒性反应（癌细胞检测）
ICD（免疫原性细胞死亡）诱导剂触发的细胞毒性反应，通常依赖特定的生物标志物来评估。这些标志物不仅涵盖传统的细胞死亡指标，还扩展到与DAMP（损伤相关分子模式）释放相关的细胞内应激反应。
传统细胞死亡标志物：
🔹质膜通透性：评估细胞死亡的最终阶段。
🔹磷脂酰丝氨酸暴露：细胞凋亡的早期标志。
🔹线粒体跨膜电位损耗：指示线粒体功能障碍。
🔹启动子或效应子caspase激活：凋亡过程中的关键酶。
DAMP释放相关的细胞内应激反应：
综合应激反应（ISR）是细胞维持稳态的关键机制，涉及ER伴侣蛋白的细胞表面暴露。
🔹监控组件：eIF2α磷酸化、XBP1的拼接、ATF6核易位，某些情况下HSPA5上调。
🔹癌症细胞中ICD相关PRR激活的测量：使用特异性抗体对关键磷酸化换能器（如磷酸化IFN调节因子）进行免疫印迹检测。
2）免疫细胞检测
吞噬能力评估：
通过将APCs或其前体与即将死亡的癌细胞共培养，并利用荧光技术，如CFSE或PKH26进行标记，我们能够通过荧光显微镜或流式细胞术直观地观察APCs对死亡细胞的吞噬情况。
另一种方法是对癌细胞进行预标记，并在与APCs共培养后使用特异性单克隆抗体染色，以监测吞噬作用。通过静脉注射预标记的死亡小鼠癌细胞，然后通过脾细胞分离和流式细胞术检测凋亡细胞摄取。
成熟状态与迁移能力检测：
为了解APCs的成熟程度，我们利用流式细胞术测量MHC II类分子和共刺激分子（如CD80、CD83和CD86）的表达水平(这些分子在成熟过程中均上调)。同时，通过ELISA或者流式检测培养上清液中分泌的细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23，来评估APCs的功能成熟。迁移能力(反映死亡细胞分泌趋化因子的能力)已通过transwell试验或专用的微流体装置进行评估。
对CTL的交叉递呈能力的评估：
当APCs暴露于经过RCD处理的癌细胞后，其交叉启动潜力通过与同基因naive T细胞共培养来评估。我们关注T细胞的增殖反应、激活状态以及功能分析。
🔹增殖反应：通过流式细胞术对先前用CFSE标记的T细胞进行检测，观察其增殖情况。CFSE的逐渐稀释可以直观地反映细胞的分裂与增殖。
🔹激活状态：使用流式细胞术和特异性单克隆抗体，我们检测了与T细胞激活相关的表面蛋白，如CD69、LAMP1和PD-1的表达情况。这些蛋白的表达水平可以反映T细胞的激活状态。
🔹功能分析：为了深入了解T细胞的功能，我们利用流式细胞术对胞内的效应分子进行了染色。这包括IFN-γ、穿孔素1 (PRF1)和颗粒酶B (GZMB)等。此外，我们还通过ELISA法检测了细胞外IFN-γ的分泌量，以进一步验证T细胞的功能。
🔹为了测试细胞毒性T细胞的交叉启动功能，采取了2种方法：一是测量APC脉冲的同类型活癌细胞的裂解情况，二是分析T细胞对特定肿瘤相关抗原（TAAs）的反应。
目前，评估死亡癌细胞在体内诱导适应性、肿瘤特异性免疫反应的能力，主要依赖于在同基因、免疫健全小鼠体内建立的小鼠肿瘤模型。
预防模型：
🔹疫苗应用：将体外经潜在ICD诱导剂处理的小鼠癌细胞用作疫苗，或作为负载未成熟同基因DC细胞的疫苗。
🔹免疫监测：在接种相同类型的活癌细胞后的1-2周内，监测小鼠拒绝肿瘤（发病率降低）或控制肿瘤生长的能力，作为保护性抗癌免疫的指标。
治疗模型：
🔹DC治疗：在免疫健全的同基因小鼠体内发展的小鼠肿瘤可通过自体DC治疗，这些DC在体外经潜在ICD诱导剂处理的癌细胞刺激，并结合免疫佐剂。
🔹淋巴细胞治疗：或利用体外由相同DC启动的自体CD8+细胞毒性淋巴细胞，并结合IL-2或其他促进体内扩张的细胞因子。
🔹疗效评估：监测肿瘤控制和小鼠存活情况，作为治疗性抗癌免疫的效果指标。
非镜检模型：
🔹远处转移模型：利用小鼠癌细胞在远离部位产生损伤，仅在一个病变部位进行治疗，同时监测未经治疗的病变部位的肿瘤控制和小鼠存活，以评估与治疗相关的全身抗癌免疫。
🔹颅内/颅外模型：创建颅内和颅外肿瘤，仅对其中一个进行治疗，监测未经治疗的病变部位的肿瘤控制和小鼠存活，以评估具有系统外展的治疗性抗癌免疫。
🔹持久性与特异性监测：在实现系统性、长期根除疾病的小鼠中，通过再次挑战癌细胞来监测免疫反应的持久性（使用相同癌细胞）和特异性（使用无关但同基因的癌细胞）。
免疫原性细胞死亡可以结合靶向药物、代谢、炎症等进行结合。下面是一些研究思路：
1）基础研究方面
可通过深入研究免疫原性细胞死亡如何的具体机制；也可深入探索免疫原性细胞死亡与疾病之间的关系；或可从时空角度探索免疫原性细胞死亡的发生发展；
2）转化研究
研究免疫原性细胞死亡开发新型药物；或利用新技术如人工智能等挖掘更多免疫原性细胞死亡的潜在靶点。
深入研究免疫原性细胞死亡的机制和应用，对于开发新的肿瘤免疫治疗策略、理解自身免疫性疾病的发病机理以及提高器官移植的成功率等方面都具有重要意义。
最后，我们为大家总结了《免疫原性细胞死亡诱导剂的分类及作用机制》。
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