9款常用引物设计软件&在线工具【内含安装包】

引物设计的工具有很多，软件的最佳搭配是Oligo 6 和Primer Premier 5 ，以Primer Premier 5 进行自动搜索、Oligo 6 进行分析评价；在线的工具，首推Primer-BLAST以及primer 3。

还有一些其它的软件/在线工具，一并做个梳理，方便大家根据自己的需求选择引物设计的工具。

1）Primer Premier 5/6

Primer Premier可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。自动搜索功能以Premier 为最强且方便易用，Oligo软件其次，其他软件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。

也具有PCR或测序引物以及杂交探针设计功能。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异 二聚体、发夹结构等。

很多人习惯于用5.0这个经典版本，并且认为比后来的更新版本更好用，我们也更推荐用Primer Premier 5.0.

2）Oligo 6/7

引物分析评价验证功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo 软件最优秀（更推荐版本7）。

Oligo主要用于引物探针的设计，引物探针的验证，一般用来和Primer Premier配套设计PCR引物。

从序列文件中搜索和选择寡核苷酸的多功能程序，应用于聚合酶链反应(PCR)，DNA测序，定点突变及各种各样的杂交研究。根据最近邻热力学值计算寡核苷酸的杂交温度和二级结构。也用于构建合成基因，在已合成的基因中发现适当的序列引物，发现和多元化一致的引物和探针，甚至发现蛋白质潜在的限制位点。

3）Primer Express

Primer Express是一款用于设计引物和探针、荧光PCR探针的设计软件，包含自动设计和手动设计两种方式。能够精确计算寡核苷酸与荧光基团鳌合后的Tm值。可以预测引物与引物之间与模板之间等的二级结构。

需要注意的是：

4）Beacon Designer 8

Beacon Designer 是 PREMIER 生物软件公司研发的qRT-PCR引物设计和探针设计软件，可以设计分子信标和 TaqMan 探针，所设计的探针可用于多元和等位基因鉴定实验。

该软件可以用来设计带有适宜长度的茎的信标探针，可以自动调整至理想的二值，检测与扩增引物间形成的交叉二聚体，因而可防止多元反应之间的竞争。该程序还可推测二级结构和相互杂交，以保证足够强的信号。

发夹结构的 Tm 值采用高精度的 Mfold 运算法则计算。此外，还可以设计野生型和突变体信标探针，用于研究基因型。

5）FastPCRy

一款快速设计各种类型PCR引物的工具，包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具。基于在标准和长PCR、反向PCR引物的设计新方法，直接氨基酸序列的简并PCR、多重PCR和电子PCR；序列比对、聚类和任何重复序列搜索。

PS.这个软件好像没有破解本，找了一圈只有7天试用版，有资源的小伙伴可以分享到评论区，十分感谢~

1）Primer-BLAST

尽管Primer-BLAST可以胜任多种不同引物的设计，但它最擅长的领域是围绕在荧光定量PCR的引物设计方面。

模板方面，可以输入纯fasta序列或者NCBI accession号，并可以规定产物大小及Tm值，还可以定义哪些位置允许引物结合或不允许引物结合。除了常见的引物长度、Tm值、GC含量设置之外，还可以规定其中的碱基组成及比例，尤其是3端的稳定性和GC含量。

2）primer3 web

免费开源，有在线版，是设计普通PCR最常用的在线工具之一；支持批量设计引物，如果做tNGS时，批量的这个功能就非常的有用了。

输入基因信息，选择物种，点击Pick Primers就能得到引物。如有特殊要求的参数可以下拉首页页面根据自己的设计需要对参数进行设置。

3）PrimerBank

PrimerBank是一个经过验证的PCR引物公共资源库，这些引物可用于基因表达量的检测或定量（qPCR）。PrimerBank包含了超过306,800个引物，涵盖了大多数已知的人类和小鼠基因。

用PrimerBank设计引物不仅可以用基因信息搜索，同样可以通过mRNA和蛋白搜索，只需利用NCBI找到对应的ID输入即可。

PrimerBank的用法很简单，选择数据库类型、物种，输入Gene ID，最后点击提交。当然也可以将基因序列与Primer Bank序列数据库进行比对，然后检索引物。

4）Primerexplore

Primerexplore专门用于设计LAMP引物的软件。Primerexplore目前有版本4和5，版本5的功能更多。（环介导等温扩增法是“ Loop-Mediated Isothermal Amplification”的简称、是2000年由日本学者Notomi独立研发的一种“简便、快速、准确、廉价”的基因扩增方法 ）

LAMP检测最大的挑战就是引物的设计。主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。正确的引物设计是成功进行LAMP扩增的关键。因为推荐使用设计LAMP引物的专用软件PrimerExplore，设计中应特别注意碱基组成、GC含量和二级结构等问题。Tm 值可以通过最近邻法（Nearest Neighbour法）获得。