讲座回顾 | 流式细胞术原理、染色全流程、应用和问题解析

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种基于单细胞水平、多参数分析分选的强大工具。它能够对大量的细胞或非细胞的颗粒进行快速、准确、多参数的高通量检测分析。其基本原理是使用荧光探针标记待检测的生物样本，通过流式细胞仪检测生物样品上的被标记的荧光信号来获取相应的生物学信息。

两大核心要素是样品的荧光标记技术和流式细胞仪。荧光标记技术的关键是荧光素分子，不同的荧光素分子有其相应的优缺点，以适应不同的应用场景。流式细胞仪则主要由液路系统、光路系统和电子系统组成，能够检测和分析悬浮在液体中的分散细胞的多个参数，如细胞大小、细胞粒度、细胞表面积、核质比例、DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量等。

在流式细胞术中，样本制备和流式染色是至关重要的一环。制备单细胞悬液时，需要尽量减少细胞死亡和碎片。死细胞会导致样品中出现团块，这些团块在免疫染色中容易粘附游离的抗体，并表现出更高水平的自发荧光，从而干扰荧光的准确测定。此外，正确的荧光标记也是关键。在选择荧光染料时，需要确认仪器带有能够激发目标荧光染料的激光器，以及能够检测该染料发射光的滤光片组合。同时，还需要注意荧光染料的组合使用，避免荧光溢漏和扩散，确保检测结果的准确性。

在染色过程中，可能会遇到一些问题，如非特异性结合、染色效果不佳等。这时，可以通过优化试剂滴定、封闭细胞Fc受体、加入细胞活性染料等方法来解决。同时，还可以利用同型对照和FMO对照来评估背景染色和抗体特异性，确保实验结果的可靠性。

流式细胞术在免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学、癌症生物学和传染病监测等领域发挥着重要作用。它不仅可以用于免疫表型分析，通过检测细胞表面抗原和细胞内标记物来定义和区分不同的细胞亚群；还可以用于细胞内细胞因子分析、细胞增殖分析、细胞凋亡分析和细胞周期分析等。