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肠道固有层 (LP) 是免疫系统中富含白细胞的黏膜屏障，因为它在免疫监视和防御外部病原体的屏障防御中起着至关重要的作用。

依据细胞类型的不同，酶会选择性地维持细胞表面的抗原特性。

本文节选了部分内容，专注于探讨如何针对特定的肠道细胞群体，挑选出最佳的酶来进行组织消化。同时，我们还介绍了一种简化的8色抗体组合方案，用以鉴别肠道固有层（LP）中的T细胞、B细胞、固有淋巴细胞（ILC）、髓系细胞及其关键亚群。

使用上述方案，我们从 8 周龄野生型小鼠（混合性别）的结肠 LP 中分离免疫细胞，用荧光团标记的抗体对其进行染色，并通过流式细胞术对其进行分析。在染色过程之前对细胞进行计数，以获得单细胞悬浮液中的总细胞数。与其他酶相比，使用胶原酶 VIII 进行组织消化可获得更多的总分离细胞数。然而，使用流式细胞术分析染色的细胞表明，无论使用哪种消化酶，从野生型 C57BL6/J 小鼠的结肠 LP 中分离的细胞在活白细胞（活 CD45+ 细胞）的绝对数量上都没有显示出任何重大差异。因此，这里测试的所有三种消化酶都将为最终分离的白细胞总数提供相似的产量。

从活 CD45+ 细胞中，总 ILCs被划分为lin-（CD3、CD5、TCRab、TCRgd、CD19、Gr-1 和 FCεR1a）CD127+ 细胞。使用表面受体和转录因子表达谱，这些细胞进一步分为 NKp46+ ILC1、RORgt+ (NKP46+/-) ILC3 和双阴性细胞等亚群。从双阴性群体中鉴定出 ILC2 为 KLRG1+ 细胞。从ILC1 中，通过 KLRG1 的表达鉴定出 NK 细胞。

不同亚群的比较分析表明，与胶原酶 D 或胶原酶 VIII 相比，Liberase TL 能够提供更好的 ILC 结果，这表明 Liberase TL 是分离和分析肠道 ILC 的最佳酶消化选择。

从活 CD45+ 总白细胞中，TCRαβ 和 TCRγδ分别用于圈门αβ-T 细胞和 γδ-T 细胞。αβ-T细胞进一步分为 CD4+ 辅助 T 细胞和 CD8+ 细胞毒性 T 细胞 。辅助性 T 细胞是肠道 LP 中在体内平衡期间发现的 CD4+ T 细胞的主要亚型。从 CD4 亚群中，使用 FoxP3 和 RORgt 表达鉴定出调节性 T 细胞 (FoxP3+ Tregs)、微生物群诱导的外周调节性 T 细胞 (RORgt+ FoxP3+) 和产生 IL-17 的 Th17 细胞 (RORgt+)。从总 γδ-T 细胞中，根据 RORgt 转录因子表达鉴定出产生 IL-17 的细胞。

对αβ-T 细胞和 γδ-T 细胞亚型的比较分析表明，与胶原酶 VIII 或 Liberase TL 相比，胶原酶 D 产生的αβ-T 细胞频率明显更高。虽然αβ-T 细胞和 γδ-T 细胞亚型的频率或细胞数量没有显著变化，但当使用胶原酶 VIII 消化样品时，转录因子的 MFI 发生了改变。这可能是由于与胶原酶 VIII 相比，Liberase TL 和胶原酶 D 的梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性较低，以及其他研究小组先前讨论过的消化酶对基因的激活。消化酶也可能改变细胞的 pH 值和代谢。总的来说，这些数据表明胶原酶 D 是用于 T 细胞分析的酶消化肠组织的最佳选择。

从活 CD45+ CD11b- 细胞中，CD19+ B 细胞使用 B220 或 MHC II 共表达进行圈门。从 TACI+ 细胞中，浆细胞被圈门为 CD138+ 的 CD19- 细胞。不同群体的比较分析表明，胶原酶 D 和 VIII 消化产生的 B 细胞在两种频率以及绝对细胞数量上均比 Liberase TL 多。相反，无论消化酶如何，浆细胞都不会改变。由于表位可能部分裂解，Liberase TL 消化的细胞 CD19 染色减少，导致与使用胶原酶 D 或胶原酶 VIII 分离的细胞相比，CD19 表达非常多变。因此，建议使用胶原酶 D 或胶原酶 VIII 分离 B 细胞。

从总活 CD45+ 细胞中，中性粒细胞 (CD11b+ Ly6G+) 被圈门，其余 CD11b+ 细胞用于通过 Ly6C与 MHC-II 来圈门。使用这种圈门策略，可以对巨噬细胞和cDC2s (MHC-II+ Ly6C-)、成熟单核细胞 (MHC-II+ Ly6C+) 和未成熟单核细胞 (MHC-II- Ly6C+) 进行分类。树突状细胞 (CD11c+ MHC-II+) 直接从总活细胞中圈门，cDC1s 和 cDC2s 分别根据其 CD11b 的阴性或阳性表达进一步分类。对所有圈门群体的比较分析表明，细胞数量 或频率没有显著变化。因此，这三种酶均可用于研究肠道 LP 中的髓系细胞。