流式死活染料那些事 | 染还是不染？看了这份攻略再决定！

死细胞具有非特异性染色。

死细胞自发荧光特别强。最后导致背景荧光增强，使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达。

死细胞还可能会释放DNA，DNA非常粘稠，会导致细胞成团，既影响结果，又容易堵塞管路。

小福建议大家组织样本和原代细胞一定要染死哦！！

当使用可固定的细胞活性染料时，Tris缓冲液和含有叠氮化钠或外来蛋白质的溶液不能作为细胞染色缓冲液，因为溶液中含有这些物质可能导致死细胞群染色强度的显著降低和/或活细胞群背景染色的增加。一般冰冷PBS 1:1000染色，含有FBS的PBS终止，建议摸索最佳浓度。

补偿样本中需要同时检测到阳性信号和阴性信号，我们提供两种方案：

准备活细胞与死细胞的混合样本：将一份活细胞样本平均分成两份，一份不做处理，一份制备成死细胞，制备完成后将两份样本重新混合，再进行染色。制备死细胞的方法请参考如下描述：可以通过60°C放置20分钟热灭活细胞。或将细胞放入70%乙醇固定，乙醇固定的细胞可以保存在-20°C，使用前再取出。

利用ArC™ 胺反应补偿珠试剂盒（货号A10346），该产品可与具有胺反应性的LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye可固定死细胞染料结合，以用于流式补偿调节，而无需自己制备补偿样本。

在缺乏特定抗原的情况下，即当这些抗原未被中枢或外周耐受机制所覆盖时，RCD仅能够触发炎症反应，而无法激活适应性免疫反应。这表明，特定的抗原存在是RCD触发适应性免疫的关键。

相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，但是可以通过信号的强弱来区分活细胞和死细胞。其中活细胞的细胞膜完整，仅细胞表面蛋白胺基结合了染料，呈现较弱的荧光信号；而死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入死细胞，与细胞内和细胞表面蛋白上的胺基结合，因此死细胞呈现更强的荧光信号。

Fixable Viability Dye流式染色结果解读。将未染色细胞和Fixable Viability Dye染色细胞流式分析结果合并分析。相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，其中死细胞呈现比较强的荧光信号，而活细胞呈现的信号较弱。

不建议，该染料对基于成像的实验效果不好，由于所有细胞都被染色，很难通过显微镜从暗淡的活细胞中分辨出明亮的死细胞。

传统的流式细胞死活染料为细胞膜非通透性的核酸染料，例如PI、7-AAD、DAPI。这类核酸染料能穿过死细胞的细胞膜，结合核酸后发出荧光，而无法穿过活细胞的细胞膜。最后染，快速上机。

但是，如果实验涉及到胞内染色，细胞需要固定破膜，核酸染料会将所有的细胞都染上颜色，难以分辨死活信号。此时您应该选择可以固定的细胞死活染料，即Fixable viability dye（细胞膜非通透性的胺反应染料）。先染死活。

核酸类死活染料和Fixable Viability Dye二者区别如下：

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