无染色？高背景？这篇内容帮你解决99%的免疫组化实验问题！
蛋白检测选择何种实验方案检测？
对比 | WB | IHC/IF | ELISA | FCM |
原理 | SDS-PAGE 结合抗原-抗体-标记物显色来检测样品中的蛋白质 | 融合免疫学原理和化学/荧光呈色反应 | 免疫学原理和化学反应显色 | 免疫荧光技术+免疫学原理+FACS |
作用 | 定性 半定量 | 定性 半定量 主要定位 | 精准定量 | 半定量 一般用来 分析和分选 |
样本 | 细胞 蛋白 | 细胞或者组织 | 多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液 | 单细胞悬液 （颗粒等） |
优势 | 最常用 成本低 | 精准定位！定性灵敏度高 | 精准定量！分泌性蛋白首选 | 分析和分选！检测细胞膜表面蛋白最为常用。 |
免疫组化结果判断对照组如何设置？
免疫组化实验常见问题及解决方案
组化实验结果最常见的问题除了无染色， 就是高背景，如果结果不理想，可以根据下方的可能问题清单逐一排查，找到问题所在！
对目的蛋白的特性了解不充分
目的蛋白表达具有组织特异性
目的蛋白表达具有细胞特异性
目的蛋白在组织中分布特异性
样本的取材和固定问题
取材不及时
固定不及时
固定条件不合适
脱蜡不足
石蜡包埋过程中抗原表位发生变化而未被一抗识别
水溶性色原显色后使用了含醇的复染液或用乙醇脱水、二甲苯透明(如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等显色试剂)
抗原修复问题
没有进行抗原修复
修复方式和条件不当
一抗孵育前抗原就损坏
抗原孵育问题
抗体不能做IHC-P
加入的一抗浓度低或者孵育时间短
一抗与样本种属不适配
抗体过期或失活
信号检测问题
一抗二抗不匹配
二抗检测体系不适合
二抗灵敏度不够
酶-底物反应受损
其他试剂问题，比如污染、过期
其它
操作不当
干片
异常/非特异性结合
样品处理不当
洗涤不充分；由于固定剂的残留而导致高的背景值
固定不充分；可能会导致抗原在组织中的扩散
弥散染色；由组织损伤导致
检测试剂的渗透不充分
不同固定剂对于组织抗原影响各异
一抗或二抗孵育前组织片干涸
封闭不当或者不充分
未封闭非特异性抗原结合位点或封闭不充分
来自内源性过氧化物酶或磷酸酶的干扰
其他来自内源性生物素活性的干扰
一抗、二抗问题
一抗的非特异性结合；如果浓度过高则会导致高背景值或非特异性结合
二抗存在非特异性结合
使用了同一物种的抗体(例如，对于小鼠组织使用了鼠抗)
高孵育温度，超过37°C
荧光IHC 中福尔马林或多聚甲醛固定剂在绿色光谱上产生自发荧光
多克隆抗体的非特异性结合
抗体浓度过高，导致非特异性结合
底物浓度过高
最后，我们给大家准备了一份IHC手册，方便给大家做troubleshooting时用。扫码添加小助手回复“组化0312”下载资料！
END
加入社群
关于福麦斯
