流式样本制备攻略 | 外周血、骨髓、细胞、组织样本制备全搞定！
小福，我最近在研究流式细胞术，能不能跟我讲讲这个技术啊？
当然可以！流式细胞术是一种非常强大的生物技术，可以用来分析细胞的多种特性，比如大小、形状、表面标记物的表达等等。样本制备可以说是流式细胞术成功的关键。如果样本处理不当，后续的分析结果可能会大打折扣，甚至完全失去意义。
能具体说说为什么样本制备这么重要吗？不同的样本又要怎么处理、有没有经验可以分享啊？
那你一定要好好看今天分享的内容！这篇文章就是带大家学习流式样本制备，所有的技巧和注意事项都总结在这篇文章了~
样本的完整性和活性对于流式细胞术来说至关重要。如果细胞在制备过程中受损或死亡，那么它们就无法准确反映原始样本的生物学特性。样本制备还包括对细胞的染色和标记，这一步是为了让流式细胞仪能够识别和区分不同类型的细胞。如果染色不均匀或者标记物选择不当，就会导致分析结果不准确。
一、流式样本类型及高质量样本判断
流式三大基本要素包括样本制备、流式抗体、流式细胞仪，其中样本必须是活力高的单细胞悬液，低活力样本会直接影响实验结果的准确性和实验数据的美观性。
样本类型有以下：
①外周血、骨髓
②培养的细胞
③组织
④生物液体
⑤植物
高质量样本需要复合四个条件：
①细胞数量：不少于107个/mL；染色体系106/100 uL；
②细胞活性：死细胞、碎片不能太多；
③抗原表位：满足细胞分选、流式检测时特异性标记抗原能被抗体标记；
④方法简易：易于操作。
二、不同样本的制备方法
1、外周血、骨髓样本制备
外周血、骨髓样本是流式实验经常使用的样本类型，常采用EDTA、肝素钠抗凝的外周全血。
有两种处理方法，一种是用溶血素裂解红细胞；另一种用Ficoll或Percoll从外周全血中分离PBMCs，从对应密度层获得目的细胞进行清洗和染色。
小鼠骨髓细胞优先保存于肝素钠中，冰上裂红时长不超过1 min。
如果是进行淋巴细胞表型鉴定，可选择裂红的方法，简单又省时，不影响白细胞的形态，但是要注意裂解时间，建议不超过10 min；如果是进行淋巴细胞功能检测（如细胞因子分泌实验、刺激培养等），可选择密度梯度离心的方法，先分离出目的细胞群，然后再进行下游实验，可减小对其干扰。
EDTA适用于白细胞免疫表型分析，能够有效阻止成熟髓系细胞贴壁以减少细胞损失，并具有强大的抗血小板聚集能力。然而，在维持细胞活性方面，EDTA的效果不如肝素。此外，EDTA作为二价阳离子的强效螯合剂，会对与Ca²⁺相关的抗原位点（例如CD11b等）产生影响，并抑制依赖于Ca²⁺的细胞功能。相比之下，肝素常用于白细胞功能研究，能够维持细胞内Ca²⁺和Mg²⁺的生理浓度，从而更好地保持细胞活性。因此，肝素更适合于需要长时间保存或无法立即检测的样本。但需要注意的是，肝素不适用于血小板相关检测。
2、细胞样本制备
凋亡样本尽可能不要用含有EDTA的胰酶，可以用Accutase消化酶。
3、组织样本制备
组织的样本保存推荐美天旎MACS组织保存液 ，安全、无损。
① 机械法
免疫器官主要由免疫细胞组成，免疫细胞之间基本是相互独立的，很少形成稳定的连接，而且免疫器官内结缔组织含量也比较少，所以将免疫器官制备成单细胞悬液相比于其他实体脏器要容易得多。在酶促消化过程中，通过轨道摇床等工具协助机械分离，帮助细胞从细胞外基质中释放出来，比如gentleMACS。
适用类型：脾脏（需裂红）、淋巴结、胸腺等免疫器官。
>> 常见的消化酶
酶的最优浓度与活性：浓度过高或许会干扰细胞表面的标记物，减少其可用性并削弱细胞在后续实验中的活性。因此，对于黏附性较弱的细胞，例如淋巴细胞，宜采用较短的消化时长及温和型酶，以防此类问题。
消化时长：这是决定性因素，需依据所用酶的种类及组织特性来定。消化不足会增加细胞粘连与碎片，而过度消化则会显著降低细胞活性，并导致更多碎片与粘连体。
消化温度：酶消化一般在特定温度（常为37°C）下进行，以保证最佳速度与效率。较低温度（如4°C或冰上）会减缓酶反应，延长孵育时间，但有助于减少细胞死亡。
对表面抗原的影响：若分析细胞表面蛋白，应避免胰蛋白酶，因其可能破坏表面受体或膜蛋白，造成免疫表型实验出现假阴性。
>> 单细胞悬液质量分析解决办法：根据文献摸条件
三、高质量样本制备方案
给大家推荐一个温和、标准化、细胞活力高的样本制备方案：
美天旎组织解离试剂盒+gentleMACS 组织处理器+C tube +裂红（可选）
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标准化的组织解离或匀浆制备；
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温和的即用型消化酶，抗原表位保存完整，获得高活性、高得率的单细胞悬液；
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均一性高、实验差异小；
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不用摸索实验条件，省时，操作简单。
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四、样本冻存
1、在染色前冷冻
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优点：此方案能够极大缩短收获后的处理时长，并确保细胞在“最新鲜”的状态下被冷冻保存。由于避免了固定样品或荧光团标记抗体的完整性因反复冻融而受损，因此冷冻保存过程对固定和染色质量的影响被降至最低。
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缺点：活细胞在经历冻融循环后，其代谢活动、表面标志物的表达以及整体活力可能会发生变化，这些变化将成为后续分析的复杂干扰因素。
2、表面染色之后，固定破膜之前
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优点：这些样本中的细胞在冷冻保存后，其表面标志物的表达不会发生因冷冻而产生的变化，且细胞依然保持存活状态。这表明冷冻保存过程并未对细胞造成显著的损伤或破裂。
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缺点：采用该方法时，与细胞结合的荧光团标记抗体会被冻结，这可能会导致信号强度的减弱，尤其是在使用串联染料时，信号衰减的现象可能更为显著。
3、所有染色后做冻存
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优点：此方法能够最精确地保留收获时TME（肿瘤微环境）的“新鲜”状态于整个染色过程中，有效防止了因处理时间延长和冷冻保存过程中压力所引发的任何表达变化。
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缺点：在固定和冷冻过程中，存在损坏质地更坚硬的细胞结构以及破坏荧光团标记的风险。
1）必要时，可使用美天旎dead cell removal kit通过磁珠分离技术去除细胞碎片和死亡细胞，以提高样本的纯度。
2）根据细胞类型和状态，选择合适的相对离心力（RCF），避免过高或过低的离心力导致细胞损伤或丢失。小福习惯的离心条件是：350g，5min，4℃。
3）在进行流式细胞术实验之前，评估单细胞悬液至关重要，需要检查细胞活性、无大量细胞碎片和无大量粘连体。多个细胞聚集在一起通过流式仪检测信号，即为黏连体信号，在分析的时候需要除去。
4）去黏连体解决办法
① 数据分析：FSC或者SSC中A、H、 W中任意两个参数，对角线部分为单个细胞。
② 染色过程：FACS Buffer 中加入EDTA，样本过滤。
③ 样本制备过程：消化时加入DNase I 。
doi:10.4049/jimmunol.2000656
听你这么一说，我觉得样本制备真的是个技术活啊！
没错，虽然它可能看起来有点复杂，但只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能够制备出高质量的样本，从而得到准确可靠的流式细胞术分析结果。
谢谢你，小福！我现在对流式细胞术样本制备的重要性有了更深入的了解了。
不客气！除了样本制备，如果你还有其他流式问题，随时都可以来找我们，我们的流式技术交流群也不要错过，群内大家随时可以一起交流讨论经验！
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