国自然热点 | Treg细胞复杂的亚群分类及检测方案！

调节性T细胞（Treg）作为免疫抑制性细胞群，通过调控过度免疫应答和维持免疫稳态发挥核心作用。根据Treg的来源与功能，其又能被进一步细分。

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01.

基于CD45RA表达分类

基于CD45RA表达，Treg可分为静息Treg (rTreg)、效应Treg (eTreg) 或活化Treg (aTreg)、非Treg (non-Treg)，该分类方法已被广泛用于研究肿瘤微环境中CD4⁺ Treg细胞的异质性。

02.

基于细胞因子分泌和转录因子表达分类

根据细胞因子分泌和转录因子表达情况，Treg可分为Th1样Treg、Th2样Treg、Th17样Treg、Th1/17样Treg、Tfh样Treg，这些也被称为Th样Treg。该分类方式没有考虑Foxp3在不同亚型中表达的稳定性，从而无法准确把握各亚群的实际功能作用，因此在各种研究中会得出不同的结果。

03.

CD4⁺Treg细胞来源和稳定表达Foxp3分类

稳定表达Foxp3的CD4⁺Treg细胞可能具有免疫调节能力，而表达不稳定的Foxp3细胞在微环境影响下可能向其他类型的T细胞转化。结合CD4⁺ Treg细胞的来源和Foxp3表达，还可以将CD4⁺ Treg亚群分类为nTreg/tTreg、iTreg等亚群。

04.

肿瘤微环境中的Treg分类

在肿瘤微环境中，Treg细胞包含多个亚群，这些亚群的分类依据是其来源和功能的专门化，且它们共同构成了肿瘤内部的Treg细胞库。在肿瘤微环境（TME）中，最为显著的Treg亚群包括胸腺来源的Treg（tTreg）、外周诱导的Treg（pTreg）、组织驻留的Treg（tr-Treg）以及滤泡Treg（Tfr）。这些不同的亚群均表达Treg的主要调节蛋白Foxp3，并共享一系列典型的Treg特征标记，如CD25和CTLA-4，用以支持其抑制功能，同时它们也各自展现出独特的特性。

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在胸腺或其他免疫微环境中，naive CD4⁺ T细胞通过TCR信号激活，并在IL-2及TGF-β等可溶性因子的协同作用下，启动向Treg细胞的分化程序。这一过程依赖于多个辅助转录因子的协同作用，它们共同调控Treg细胞的命运决定和表观遗传修饰（如Treg细胞特异性脱甲基化区域的建立），从而确保FOXP3的稳定表达。

05.

转录因子对Treg细胞的调控

Treg细胞进一步分化为效应性Treg细胞的过程受到FOXP3依赖性和FOXP3非依赖性转录因子的双重调控。这些因子不仅能促进FOXP3的表达，还能增强抑制性细胞因子的产生。然而，某些转录因子（如NFIL3）可抑制FOXP3的表达，从而精细调节Treg细胞的功能。

成熟的效应性Treg细胞还能激活额外的转录程序，这些程序通常由调控常规T细胞分化的转录因子驱动。这些机制赋予Treg细胞独特的亚群特征，例如组织归巢能力的形成，使其能够适应不同的免疫微环境并发挥特异性调控功能。

📍 Treg细胞的分化及FOXP3的表达受多重信号协同调控：

核心激活信号：

①TCR-MHC II抗原识别：抗原呈递细胞通过MHC II-抗原复合物激活TCR；

②IL-2-CD25/STAT5通路：IL-2通过CD25-STAT5信号模块传递增殖与分化信号；

③TGFβ-SMAD经典通路：介导Treg细胞谱系定向分化。

微环境信号整合：

环境中的细胞因子及内源性化合物（如色氨酸代谢物）通过特定受体（如AHR、RORγt）被感知，进一步调控Treg细胞的可塑性。

转录调控网络

在FOXP3基因的保守非编码区（CNS），多种转录因子（如BACH2、MAFK、Ikaros家族蛋白、RUNX1、FOXO1、SATB1及NFIL3）形成动态复合物，通过以下机制精确调控Treg功能：

①稳定FOXP3表达；

②启动抑制性功能程序（包括细胞接触依赖机制和可溶性因子分泌）。

在Treg细胞分化过程中，转录相互作用导致抑制性和刺激性转录因子和复合物的瞬时组装，它们独立地或与FOXP3一起抑制或诱导参与维持标志性调节性T细胞基因和组织内特定功能的基因的表达。

06.

Treg的流式检测

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推荐的Treg检测操作步骤

以下操作步骤可以在单细胞水平同时分析细胞表面分子和细胞内抗原，包括核抗原。该操作步骤将固定和破膜结合到一个步骤中，推荐用于检测核抗原如转录因子，但也可用于检测许多细胞因子。有关Foxp3 /转录因子染色液组合与细胞因子抗体的兼容性，请参阅抗体固定注意事项以得到更好的抗体克隆性能。

材料

● 12 x 75 mm圆底试管或 96孔V型或U型底微量滴定板

● [可选]可固定细胞活性染料（FVD）eFluor 455UV、450、506、520、660和780

● [可选]正常小鼠血清

● [可选]正常大鼠血清

● 荧光偶联抗体

● Foxp3 /转录因子固定破膜染色液组合

● 流式细胞分析染色

缓冲液和溶液制备

● 将1份Foxp3固定/破膜浓缩液与3份Foxp3 固定/破膜稀释剂混合，制备新鲜的Foxp3固定/破膜工作液。如果在管中染色，则每个样品需要1 mL工作液。

● 将1份10X透化液与9份蒸馏水混合，制备1X破膜液工作液。如果在管中染色，则每个样品需要8.5 mL工作液。

12 x 75 mm管的实验步骤

1. 制备单细胞悬液，请参阅流式细胞细胞制备最佳操作步骤。

2. [可选]使用固定化活力染料对细胞进行染色，更多详情请见“不同细胞活性染料的操作步骤汇总”，操作步骤 C。

3. 对细胞表面标记进行染色，有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色。

4. 最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解沉淀，通常保留约100 μL残余体积。

5. 向每个管中加入1 mL Foxp3固定/破膜工作溶液并脉冲涡旋。

6. 2-8°C或室温孵育30-60分钟，避光。（小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。

7. 每管加入2 mL 1X破膜液，在室温下400-600 x g离心样品5分钟，弃上清。

8. [可选]重复第7步。

9. 在剩余体积的1X破膜液中重悬沉淀，通常为100 μL。

10. [可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭或使用流式专用的封闭试剂，在室温下孵育15分钟。

11. 不洗涤，加入推荐量的荧光偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上，避光。

12. 每管加入2 mL 1X破膜液，在室温下400-600 x g离心样品5分钟，弃上清。

13. 重复第12步。

14. 将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

15. 通过流式细胞术分析样品。

96孔板实验步骤

1. 制备单细胞悬液，请参阅流式细胞细胞制备最佳操作步骤。

2. [可选]使用可固定细胞活性染料对细胞进行染色，更多详情请见“不同细胞活性染料的操作步骤汇总”，操作步骤 C。

3. 对细胞表面标记进行染色，有关详细信息，请参阅细胞表面靶标染色。

4. 最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解沉淀。

5. 每孔加入200 µL Foxp3固定/破膜工作溶液，最好使细胞完全重悬于添加的溶液中，可选择移液。

6. 2-8°C或室温孵育30-60分钟，避光。（小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。

7. 在室温下400-600 x g 离心样品5分钟，弃上清。

8. 每孔加入200 µL 1X破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟，弃上清。

9. 重复第8步。

10. 在剩余体积中重悬沉淀，用1X破膜液将体积调节至约100 μL。

11. [可选]直接向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭或流式专用的封闭试剂，在室温下孵育15分钟。

12. 不洗涤，加入推荐量的直接偶联抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育30分钟以上，避光。

13. 每孔加入200 µL 1X破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟，弃上清。

14. 重复第13步。

15. 将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。

16. 通过流式细胞术分析。

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07.

Treg资料分享

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参考文献

[1] Trujillo-Ochoa, J.L., Kazemian, M. & Afzali, B. The role of transcription factors in shaping regulatory T cell identity. Nat Rev Immunol 23, 842–856 (2023). https://doi.org/10.1038/s41577-023-00893-7

[2] Lin H, Xu Y and Lin C (2024) Heterogeneity and subtypes of CD4 regulatory T cells: implications for tumor therapy. Front. Immunol. 14:1291796.

[3] Kang JH, Zappasodi R. Modulating Treg stability to improve cancer immunotherapy. Trends Cancer. 2023;9(11):911-927.

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