胶原酶、分散酶、胰蛋白酶...，一文看透不同样本消化酶的选择！

做流式和磁珠分选的小伙伴们都知道样本制备非常关键，不同的组织选择不同的酶组合搭配去消化组织。但是大家经常不知道怎么去选择消化酶，今天小编给大家简单总结一下消化组织常用的酶！

问

不同样本如何选择消化酶？

首先大家要明确组织解离的本质，即通过机械法（剪切研磨、吹打等）或者酶消化（胶原酶、蛋白酶等）的方式，首先破坏细胞外基质，将细胞从细胞外基质中释放出来，然后再破坏细胞与细胞之间连接，制备出细胞相互间独立悬浮于缓冲液中的细胞集群。

依照样本类型不同，需要配置不同的酶混合物，将切碎的组织块置于消化酶混合物中并在特定温度下孵育进行酶解离。

不同的最佳酶活性一般具有温度特异性，因此在合适的温度下能够以最高效率解离组织，通常酶解温度为37℃，也可以在4℃或冰上进行，这取决于所用酶的性质。一般较低的孵育温度会降低酶的反应速度从而延长酶解时间，但低温孵育可以减少细胞死亡。选择消化酶混合物用于制备用于单细胞悬液时，酶活强度、酶浓度以及孵育时间是最重要的三个考虑因素。

根据不同解离酶的消化特性，对其功效大小比较如下：

胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>弹性蛋白酶>透明质酸酶>胶原酶（5 > 2 > 1 > 4 > 3）>中性蛋白酶> DNase I

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分解细胞外基质的酶：弹性蛋白酶透明质酸酶胶原酶中性蛋白酶

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破坏细胞连接的酶：胰蛋白酶木瓜蛋白酶

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DNA酶：脱氧核糖核酸酶Ⅰ

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EDTA（乙二胺四乙酸）

问

常见的消化酶有哪些？

1、胶原酶

胶原酶(Collagenase)能够特异性识别胶原蛋白中的Pro-X-Gly-Pro序列，并切割该序列中的中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之间的肽键的肽链内切酶，且能够水解结缔组织中的胶原蛋白。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。目前商用胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等不同类型，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。为获得最佳结果，胶原酶的工作浓度需要根据组织以及参考文献进行调整。

胶原酶类型	适用实验
Collagenase I	主要用于上皮、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的分离
Collagenase II	含更多的梭菌蛋白酶活性，适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的分离
Collagenase III	含低蛋白水解活性，对消化组织中连接部分较为有效，常用于哺乳动物组织细胞解离用，如新生、腺体组织解离，需配合其它消化酶消化
Collagenase IV	包含至少7中蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。常用于胰岛和受体完整性的细胞制备
木瓜蛋白酶	Collagenase V

2、分散酶

中性蛋白酶(Dispase)也称分散酶，来源于枯草杆菌，无支原体或其他动物病毒污染。具有比较温和的蛋白水解酶活性，对细胞损伤小且可维持细胞膜完整性，因此非常适合用于分离原代和继代细胞培养。分散酶还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集。常与胶原酶或其他蛋白酶结合使用。

3、脱氧核糖核酸酶Ⅰ

脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DeoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)不会破坏细胞完整性。主要作用是消化因细胞损伤释放到溶液中的DNA，从而增加粘度和活力，防止结块。

4、胰蛋白酶

胰蛋白酶(Trypsin)为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。胰蛋白酶可应用于肝、肾、甲状腺等组织消化，需要配合其他蛋白酶如胶原酶或弹性蛋白酶一起使用。

5、透明质酸酶

透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)是能使透明质酸产生水解作用酶的总称，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。常与胶原酶等天然蛋白酶联合，用于解离结缔组织。

6、木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶(Papain)用于细胞培养，在准备细胞培养液的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10 min后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身。相较于胰蛋白酶、弹性蛋白酶，木瓜蛋白酶能讲解大多数蛋白底物，常用作解离皮层神经元、视网膜、平滑肌等组织。

7、弹性蛋白酶

弹性蛋白酶(Elastase)是猪胰腺来源的一种丝氨酸蛋白酶，催化蛋白和多肽水解（尤其是仅次于中性氨基酸残基的肽键）。在所有蛋白酶中弹性蛋白酶非常独特，因其能水解天然弹力素。在血液和细菌内都有发现弹性蛋白酶。研究发现，弹性蛋白酶很适合用来消化肺脏以分离肺泡II型细胞。

8、EDTA

是2价阳离子螯合剂，它可以鳌合Ca2⁺或Mg2⁺，而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2⁺或Mg2⁺的，把这些离子鳌合后，能促进消化和细胞分离。特别是上皮类细胞的连接存在“桥粒”结构，是细胞间最牢固的连接，而桥粒的形成依赖于钙离子的存在。

最后，给大家总结一下不同消化酶的特点：

酶的种类	作用效果	适用组织类型
胶原酶	水解结缔组织中胶原蛋白	纤维性组织、上皮及癌组织
胰蛋白酶	使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散	对一些粘性的组织消化效果佳，如肠道组织
弹性蛋白酶	对邻近中性氨基酸的肽键具有特异性	用于解离包含大量细胞间纤维网络的组织
透明质酸酶	降低组织黏度，提高组织的通透性	与胶原酶一同使用，结缔组织的解离
木瓜蛋白酶	可降解大多数蛋白质底物	与蛋白酶相比，木瓜蛋白酶对某些组织的损害更小
DNA酶	消化核酸而不损坏完整细胞	与胶原酶，胰酶等一同使用
分散酶	比较温和的蛋白水解酶活性，对细胞损伤小且可维持细胞膜完整性	非常适合用于分离原代和继代细胞培养

问

单细胞悬液质量如何优化？

细胞悬液质量分析	原因分析	解决方案
细胞数量少活性低	1、酶活力太强 2、酶浓度过高 3、消化时间过长	1、换活性较弱的酶、或者对细胞损害小的酶 2、降低酶浓度 3、缩短消化时间
细胞数量少活性合格	1、消化不完全，酶选择不合适、或酶量不足 2、酶解条件不合适 3、组织样本量不足	1、换消化力强的酶、或增加酶浓度、使用活力更强的酶 2、改善酶解条件 3、增加组织样本量
细胞数量够活性低	1、组合酶消化效果好，但细胞损伤大 2、物理损伤，操作动作剧烈	1、减少酶用量、或换用活性更低的酶 2、减少清洗次数、操作轻柔、换用宽口枪头
细胞悬液过于粘稠	1、细胞裂解后，释放大量DNA 2、组织中杂质干扰，非蛋白质物质过多	1、减少搅拌、组合酶中添加DNA酶I 2、尽可能去除附着组织，组合酶中添加透明质酸酶