外周血高质量样本制备秘籍！裂红法 密度梯度离心法（含高频问题QA）
在流式细胞免疫表型检测中，全血样本因其操作便捷性成为优选方案，既能有效维持细胞结构完整性，又可最大限度减少细胞损耗。需特别注意的是，全血中红细胞与有核细胞的比例通常高达600:1（存在样本来源和物种差异），因此在检测稀有细胞亚群时需适当增加样本量以提高检出率。
方法 | 溶血法 | 密度梯度离心法 |
所需血量 | 100 μL | |
优点 | 操作简单/得率高 | 避免红细胞的干扰，PBMC纯度较高 |
缺点 | 裂解程度不好控制 | 耗时长，要求高 |
适用检测 类型 | 流式表面指标分析检测 | 后续需要冻存/须做刺激培养或胞内因子实验 |
一、裂红法
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样本要求
1）使用肝素采样管采集全血，或使用含有10% EDTA二钾（1 μL/100 μL全血）的采样管。
2）取100 μL未裂解的全血样本加到12×75 mm试管中，分别作为抗体染色管和单色对照管（用于补偿调节）；剩余未裂解的全血样本可制备未染色空白对照管。
Tips
EDTA适用于白细胞的免疫表型分析，可防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失，并具有较强的抗血小板凝集能力，但对细胞活性的保持不如肝素抗凝。同时EDTA是二价阳离子的强螯合剂，会影响与Ca2+相关的抗原位点（如CD11b等），并会抑制与Ca2+ 相关的细胞功能。肝素常用于白细胞功能研究，可维持Ca2+和Mg2+在细胞内的生理浓度，更好保持细胞活性，适用于放置时间较长、不能及时检测的样本，但不适合血小板的相关检测。
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裂红步骤
1）采集人或鼠的外周血样本于抗凝管中，室温保存，血液样品离体建议2 h内处理效果最佳，若无法及时处理，4℃保存，12 h 内处理；
2）取新鲜抗凝血100 μL，加入900 μL的1×红细胞裂解液，轻柔吹打混匀，室温下裂解4-15 min；
3）加入4 mL PBS，轻柔混匀重悬沉淀；
4）4°C，350×g离心5 min，小心弃去红色上清；
5）计数活细胞，在细胞染色缓冲液中以相应浓度重新悬浮细胞沉淀。
Tips
1）小鼠的血液裂解4-5 min已经足够；
2）人的外周血，宜延长裂解时间至 10-15 min，裂解过程中轻轻摇动以促进红细胞裂解；
3）少量残留红细胞不会干扰后续检测，可以在流式分析中通过设门排除。如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤裂红1-2次；
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效果判断
1）通过观察样本的浑浊度评价红细胞裂解程度：当样本从浑浊变得澄清时，红细胞裂解完成；
2）上机检测时如何判断裂红效果：白细胞群体应清晰可辨，无大量红细胞干扰。可以染死活和CD45判断。
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优势
1）不含固定剂,能够温和而快速地裂解红细胞,而对于白细胞没有影响,使其维持基本形态与活性,不影响下游实验；
2）适用种属和样本范围广；
3）可在室温裂解,不需要低温条件。
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Troubleshooting
1）裂不干净，上机异常
a. 试剂选择不对、使用浓度不对或保存温度不对（看说明书），10×需要用ddH2O稀释至1×后使用，稀释后一个月内使用完毕。
2) 小鼠&大鼠外周血红细胞裂解难度分析与优化策略
裂解难度高原因分析
a. 细胞膜特性差异
■ 膜成分特殊：鼠类红细胞膜富含胆固醇与鞘磷脂，形成更致密的脂质双层结构，机械强度显著高于人类红细胞。
■ 抗氧化能力突出：鼠类红细胞内抗氧化酶（如SOD、过氧化氢酶）活性较高，可抵抗裂解液中的氧化损伤，延缓膜破裂。
b. 形态学差异
■ 体积小且膜厚：小鼠/大鼠红细胞直径约5-7 μm（人类约7-8 μm），膜厚度增加约20%，需更高裂解压力才能破坏膜结构。
■ 血红蛋白稳定性：鼠类血红蛋白四聚体结构更稳定，在低渗或化学裂解条件下变性速率较慢。
解决方案
a. 适当提高裂解液的剂量,以增强裂解效果。
b. 延长裂解时间。
c. 可以重复裂解步骤1-2次，但需注意避免过度裂解导致白细胞损伤。
d. 适当降低离心速度(如300-400g)以避免白细胞丢失。
二、密度梯度离心法
Ficoll
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Ficoll方法介绍
针对全血样本中PBMC的提取，通常采用Ficoll密度梯度离心试剂进行分离。Ficoll的主要成分是聚蔗糖-泛影葡胺，其性质温和且平均分子量达到400,000。在密度为1.2 g/mL的情况下，它并未超出正常生理性渗透压，也不会穿过生物膜。在全血样本中，不同种类的细胞具有不同的密度。红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.092 左右，淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低,，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC 密度稍低于分离液，位于分离液界面之上，移去上层组分就可获得 PBMC。
Tips
a. 人外周血提取Ficoll密度选择：1.077，但是小鼠外周血提取Ficoll密度选择：1.084。
b. Ficoll温度低时，离心后白膜层较为分散，建议Ficoll从冰箱中拿出来之后，先恢复到室温。
c. 仔细阅读说明书，根据说明书的要求进行实验操作。
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搭配使用优势
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2）分离液倒入分离管后，直接倒入抗凝血，无需采取谨小慎微的操作方式，将传统的约一小时分离时间缩短至15分钟，无需踩闸车，安全无毒。
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Troubleshooting
Percoll
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Percoll 方法介绍
Percoll是1978年发布的一款密度分离介质，成分是PVP（聚乙烯吡咯烷酮）包裹的硅胶颗粒，分离细胞更精密。外周血中PBMC包括淋巴细胞和单核细胞，各类免疫细胞体积、密度等有所不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
Tips
小鼠一般使用40%和80%的Percoll进行分离。
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Percoll 的配制的两种方法
1）按照百分比用两步法计算：用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液，得到 100% 的 SIP 溶液。在此基础上，比如想要得到 44% 和 67% 的工作液，分别按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖：SIP=（100-44）：44 和（100-67）：67 的比例取相应体积的溶液进行配制即可。
2）根据密度进行一步法计算，该计算方法需要知道最终配制的溶液的密度、细胞分离液的密度（Percoll 密度范围 1.130.005 g/ml，具体密度可根据批次号在英文官网中查询 COA 获得），以及用于稀释的 buffer 的密度（1.5M 的 NaCl 密度为 1.058 g/ml，2.5M 的蔗糖的浓度为 1.316 g/ml）。
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