流式数据不好？可能从实验设计就出错啦！细节秘籍：多收events
在细胞染色前进行细致的实验设计和规划至关重要，它能提升数据质量并避免因统计意义不足而重复实验。这几个流式数据的常用参数请熟记于心，您将以此为基础开展流式数据分析！
事件（Events）
事件代表流式细胞仪检测到的单个颗粒（如细胞）。高于阈值的电信号才能被记录为事件。
分辨率（Resolution）
流式细胞仪在测量时所能达到的最大精度。
CV值（Coefficient of Variation）
是衡量仪器检测信号稳定性和精密度的重要参数，通常以百分比（%）表示。CV值越小，说明数据的一致性越好，仪器的性能越稳定。CV=标准差(SD)/平均值(Mean)×100%。流式细胞仪FSC和荧光信号的荧光通道全峰宽或半峰宽CV值应不大于2%。
细胞频率（Cell frequency）
指的是特定细胞亚群在目标分析群体（通常是一个门内的细胞）中所占的百分比（%）。它是最基本、最直观的流式数据分析结果之一。
接下来，就带您详解，流式数据的常见参数受何影响，又如何表征实验结果的！
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CV值
在流式细胞术中，CV值通常用于评估：
1）荧光信号的分布宽度（如微球或细胞的荧光强度变异程度）；
2）仪器的光学和电子系统稳定性，如激光、PMT、液流系统等；
3）评估样本数据的可靠性：CV值越小，样本数据的变异越少，数据越可靠。在流式细胞术检测淋巴细胞亚群时，高比例细胞群（≥30%）多管检测的CV值应≤8%，低比例细胞群（<30%）多管检测的CV值≤15%。
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细胞频率
细胞频率（Cell frequency）是流式实验的关键考量因素，直接影响荧光染料选择和需收集的细胞数量（尤其对罕见细胞群体）。
01
确保足够数据量
若目标细胞频率低于1%，通常需要染色并采集更多细胞以确保足够数据量。实验前请务必参考相关文献和预实验摸索条件，以全面优化实验方案。
此外，即使初始群体中含有T细胞等常见细胞类型，若采用针对T细胞亚群的精细化设门策略，也需考虑细胞频率降低的影响。虽然获取了10万个细胞，但经过目标细胞识别设门后，最终门内仅剩992个细胞。随着设门复杂度的提升，采集足量细胞对确保目标群体真实性（避免人为假象）至关重要。
02
荧光染料的影响
细胞频率同样受荧光染料选择的影响：针对低密度抗原（表达量低的抗原）或罕见细胞群体，推荐选用高亮度荧光染料——阴性群体（背景区域）的染色干扰可能掩盖弱信号。在细胞分选实验中，目标群体的频率直接影响实验成败：需准备足量起始样本以获得足够的下游实验细胞。此外，频率越低，分选耗时越长；当分选时间超出合理范围时，需考虑调整纯度要求以平衡效率。
03
不同物种的影响
以下表格可帮助您确定常见人源、小鼠及大鼠组织中的细胞频率【所列数值均为样本白细胞占比（%），仅供实验参考。实际值可能因样本制备、个体差异及动物品系不同而波动。建议做预实验摸索样本目标细胞表达量。】
人细胞频率-外周血
小鼠细胞频率
大鼠细胞频率
此外，流式数据中的统计参数也一并在此介绍~
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统计参数
(1) Mean：算术均值，当流式结果为线性正态分布时，Mean更接近MFI，代表流式实验为细胞周期倍体等线性轴的结果。
(2) Geometric Mean：几何平均值，它总是小于或等于算术平均值，当流式结果为对数正态分布时，Geo Mean更接近MFI，代表流式实验为一些普遍蛋白表达类的结果，例如一些在细胞上全部表达的蛋白指标。
(3) Median：中位数是50% events的相对荧光强度，流式结果是对数，而非正态分布，此时通常推荐选择Median，Median不受数据形态分布的影响，不需要是正态分布，可以减少异常值对整个数据的影响，是流式里面用的比较多的一个统计值。
(4) Mode：使用比较少，Mode往往只是为了统计最高峰，对应流式就是表达最多的细胞所在荧光强度，这种只在很少的情况下才会和MFI重合。
(5) Freq. of Parent：圈门内细胞群的events数目占上一级圈门的百分数。
(6) Freq. of Grandparent：圈门内细胞群的events数目占上级圈门的上级圈门中events中的百分数。
(7) Freq.of Total：此圈门内细胞群events数目占收集的总细胞的比例。
(8) Freq.of _ : 自定义比例计算，此圈门events数内占某一层级群体数目的比例。
(9) rCV (Roubust CV)：稳健变异系数，rCV等于rSD除以群的中值，定义为 rCV = rSD / Median。
(10) SD值：标准偏差是对数据集分布的度量。较低的值表明数据点更接近平均值，对平均值的置信度更高，我们一般统计不涉及该参数的计算，而是基于样本数量，在把所有样本数据进行输出的时候自动计算的。
(11) rSD (Roubust SD)：rSD与一般的标准差不同，它不易被离群点影响。定义为 rSD = 0.75 ×(Q3-Q1)，其中Q1和Q3分别为群的第25百分位数和第75百分位数，计算染色SI指数时会用到。
(12) Percentile：n%以下events的荧光强度，n等于50时，等于Median。
(13) Median Abs Dev：中位绝对偏差是衡量总体方差的可靠指标，来自检测的总体中位数中每个细胞的绝对偏差的中位数。
(14) MADP*：中位绝对偏差百分比，等于100乘以中位绝对偏差除以中位数，是在标准化量表上的帮助理解的方差度量。
(15) Count：圈门或者群体中的events数目。
在我们设计实验时，需要综合考虑实验物种、荧光染料、目标细胞等，这些共同影响着我们收集到的流式数据，如果我们可以收集到足够数量的events，可以避免许多偏差，以提高流式实验结果的可信度和准确度。综上所述，流式数据的精准度与events数据息息相关。
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