血泪总结血清使用避雷事项 | 保存、解冻、沉淀、污染、热灭活......
在细胞培养实验中，血清是不可或缺的关键试剂，对于细胞生长有重要意义，那么，如何正确保存和应对血清的常见问题呢？今天就带大家细数一下关于血清保存、血清沉淀等13个问题，并附上对应解决方案！
一
血清的保存
血清该如何保存？
血清在生产制备完成后，通过质量检测，然后被运送至市场上销售。整个过程中，包括运输流程，储存温度应严格保证在-20℃，避免反复冻融影响血清活性。实验人员在收到血清，检查完好后，及时将血清送至-20℃冰箱中储存，用时再取出解冻。如果一次无法用完一瓶，应该无菌分装后冷冻保存。注意避免反复冻融。
二
血清沉淀
血清沉淀是什么？
用于细胞培养的胎牛血清及其他血类制品中均存在各种类型的沉淀，如纤维蛋白和磷酸钙等。造成血清发生絮状沉淀的原因主要是血清解冻过程中温差带来了脂蛋白变性和纤维蛋白析出，一些絮状沉淀主要就是纤维蛋白，通常我们肉眼可见，大小在1-2 mm之间；而磷酸钙在显微镜下观察呈现布朗运动的小黑点，通常被误认为是微生物污染。
血清沉淀会影响细胞培养吗？
血清在出厂前都会进行一系列质检测试，确保血清质量达到严格标准。血清测试和细胞培养经验也表明，其沉淀成分不会影响血清作为细胞培养添加物的表现。
磷酸钙颗粒经常会被当成微生物污染而引发不必要的担忧，排除血清沉淀是污染的方法 ：将血清接种在细菌培养基上培养，观察是否有细菌的增殖，然后进行革兰氏染色，并在油镜（100X10倍）下观察确认是否存在微生物污染。
应该怎样操作以尽量避免沉淀出现？
（1）正确解冻：从-20℃取出，置于4℃冰箱缓慢解冻，最后置于室温完成解冻。不要直接从-20℃拿到室温或 37℃水浴解冻，这样非常容易产生沉淀。在解冻过程中，时不时缓慢摇晃瓶子，可以减少沉淀的产生。
（2）血清沉淀在以下条件下可能会有增多，注意避免有下列操作：
出现血清沉淀该如何处理？
若想去除沉淀，我们建议您采用5000 rpm 离心5分钟，或配置完全培养基后，用0.22 μm的过滤器去除沉淀。
血清中的小黑点是“黑胶虫”么？
血清解冻过程温差过大、经反复冻融或通过热灭活处理后更容易产生沉淀，这些沉淀物在镜下观察时有一些会呈现以布朗运动的小黑点，业内流行一种“黑胶虫”污染的说法，但“黑胶虫”一直以来都是极为神秘的存在，至今科学家们也没有完整的实验结果可以证实它究竟是一种生物还是非生物，更有人认为“黑胶虫”是血清的原虫，或误以为是细菌或真菌污染。但科学家通过进一步的研究发现它们更可能是血清中的蛋白结晶。这种结晶可能为蛋白析出，如纤维蛋白原凝结成纤维蛋白；或是盐析出，如磷酸钙等；也有一些是胆固醇和脂肪酸。以下图片就证实了这一说法，如纤维蛋白和磷酸钙。
上图分别为纤维蛋白在低倍镜和高倍镜下观察到的图像，下图为磷酸钙在低倍镜和高倍镜下观察到的图像（箭头指示的是我们看到的“黑点”）
三
血清其他常见问题
如何判断血清污染？
（1）首先检查并判断外包装是否有破损，一般瓶身破损的血清发生污染的可能性极大；
（2）将血清接种到血酯板上，培养后看是否有菌落形成；
（3）可通过质量检测试剂盒检测结果判定，如支原体检测试剂盒等。
如何处理污染的血清？
血清污染主要包括细菌污染、真菌污染和支原体污染。
处理方式如下：
（1）若确定血清存在细菌污染，可尝试使用5-10倍浓度青链霉素双抗冲击培养24-48 h；
（2）真菌污染的细胞无法抢救，应立即将细胞瓶进行高压灭菌处理，并彻底消毒培养箱；
（3）支原体污染可考虑更换早期代次细胞，或使用商品化支原体去除试剂。
细胞形态不正常、生长状态异常
或增殖速率缓慢是否与血清有关？
细胞形态异常需要综合关注细胞代次、传代操作、培养基和血清等诸多因素。如传代次数过多或传代时间过晚都有可能影响细胞的生长状态。有些细胞对血清具有一定适应性，更换新批次血清时，可能出现所含因子水平的差异而导致的细胞生长状态受到影响的现象，可以通过血清梯度替换或者增加细胞适应时间来解决此类问题。与此同时，也要关注基础培养基和传代操作等方面是否存在一定问题。
如何做血清的梯度替换？
当细胞培养实验需更换血清品牌时，做程序性梯度替换方案尤为重要，因为不同品牌的血清所含成分有所差异，血清更换会使细胞发生不适，从而出现细胞增殖缓慢或细胞状态不佳等情况。
建议的梯度替换方法：
（1）完全培养基配置过程中先用25%新血清与75%原血清进行混合，培养传代1-2次；
（2）而后用50%新血清与50%原血清混合培养传代；再用75%新血清与25%原血清混合培养传代；
（3）最后完全使用新血清培养传代。
培养基中添加血清和抗生素后
可长期保存吗?
新鲜培养基中添加血清和抗生素后，建议在2周内使用完。
血清的热灭活是必须的吗?
实验表明，经热灭活处理的血清，对细胞生长可能仅有微小促进或完全没有任何作用，甚至通常因高温处理而损失掉血清中部分营养成分，而影响血清质量，造成细胞生长速率降低。热灭活过程中因局部温度过高、摇晃不均匀或灭活时间过长，都会造成血清品质下降，且经热灭活后的血清会增加发生蛋白沉淀概率。因此，若非必须血清不需要做热灭活，而少数对补体敏感的细胞实验，如某些免疫学实验或腺病毒包装等，可酌情对血清进行热灭活操作。
血清热灭活应如何操作？
（1）热灭活前，必须先将解冻后的血清摇匀，并恢复至室温；
（2）取部分摇匀血清置于50 mL离心管中，并准备同规格对照管一个；
（3）对照管内加入血清等体积水；
（4）对照管内插入温度计进行温度预试，当温度达到 56℃时将恢复至室温的血清放入水浴锅30 min；
（5）灭活过程中需要每隔5 min轻轻晃动摇匀，以保证温度均一。
血清为什么存在批间差？
血清批间差是客观存在的，因为血清制品来源于天然活体，供体牛只的生理状况、健康状况均不同，且受饲养环境的地形、风貌、饮食、水源等影响，体内各类蛋白、生长因子和酶类的含量均有巨大差异，所以血清具有含量复杂且不固定的特性，批间差异在所难免，因此批间差异小的血清不仅可以保证血清质量，确保细胞培养效果，还能减少由于批间差异带来的使用前测试，且避免实验结果的不可重复性。
血清
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